靶向线粒体转录因子A大鼠活体RNA干扰实验动物模型的建立

1、靶向线粒体转录因子A大鼠活体RNA干扰实验动物模型的建立         10-09-03 09:01:00     编辑：studa20                   作者：林恒唐春吴乔冯春林张玉君别平【摘要】  目的：在体外构建并筛选出靶向线粒体转录因子A（TFAM）的有效RNA干扰慢病毒

2、载体，用于大鼠整体RNAi实验，观察其对肝组织中目的基因表达的干扰效果。方法：设计4条siRNA序列并合成双链DNAoligo，制备目的基因RNA干扰慢病毒载体，体外感染目的细胞，利用RT-PCR和Western blot的方法检测目的基因TFAM的表达情况，从而筛选出有效的干扰靶点。构建大鼠活体RNAi动物模型，观察大鼠肝脏中靶基因表达的变化情况。结果：酶切鉴定及测序结果均提示siRNA序列成功连接入载体中。RT-PCR结果提示3号靶点的干扰效率最高，达到了55左右，Western blot也验证了其干扰的有效性。大鼠活体RNAi结果显示，肝脏中目的基因的表达也明显减少，这种表达减弱具有特异

3、性和靶向性。结论：TFAM靶向RNA干扰慢病毒载体构建成功，能有效抑制目的细胞中线粒体转录因子A的表达。构建的慢病毒载体在大鼠活体内也具有良好的干扰效果。该研究为下一步利用此慢病毒载体进行活体RNA干扰打下了基础。 【关键词】  靶向线粒体转录因子A·RNA干扰·慢病毒载体·模型，动物·大鼠，Wistar【ABSTRACT】 Objective: To construct a recombinant lentivirus vector of RNA interference targeting mitochondrial transcripti

4、on factor A （TFAM） gene and to select the most efficient small interfering RNA （siRNA） to suppress TFAM in target cells, and  to use the selected lentivirus vector in vivo and to analyze its efficacy. Methods: According to Genbank information of TFAM, four siRNA and double strand DNA were desig

5、ned, synthesized and inserted into the lentivirus vector. The recombinant lentivirus vector system was confirmed by PCR and sequencing, then it was used to transfect the target cells. The change of TFAM expression was determined by PCR and Western blot. The most efficient lentivirus vector was selec

6、ted and used in vivo. The change of TFAM expression in liver was assessed. Results: The results of enzyme digestion and sequencing showed that the recombinant lentivirus vector was constructed successfully. The result of RT-PCR showed that target 3#  had the highest interfering. Efficiency （abo

7、ut 55%） and Western blot analysis confirmed its efficacy. The result of RNAi in vivo also proved its efficiency. Conclusion: The recombinant lentivirus vector of RNA interference targeting TFAM has been successfully constructed. It can effectively suppress TFAM expression in vitro and in vivo.【KEY W

8、ORDS】 Mitochondrial transcription factor A·RNA interference·Lentiviral vector·Rats,wistarRNA干扰（RNA interference，RNAi）可用于生物学研究和药物研制，并可作为疾病的一种治疗手段。现已发现一些有治疗作用的siRNA1，但siRNA如何有效地进入体内并传递到合适的靶器官和靶细胞尚不明确，文献报道，用于活体内传递siRNA的方法包括化学修饰形成共轭体（如脂质体）2、与多肽、聚合物或抗体结合形成复合物3以及用病毒作为载体等。本研究设计合成靶向线粒体转录因子A（m

9、itochondrial transcription factor A，mtTFA，TFAM）的siRNA，并利用慢病毒载体系统将体外实验筛选出的有效siRNA通过门静脉传输至大鼠肝脏，观察其体内的干扰活性，从而构建出大鼠活体RNA干扰实验动物模型，为下一步实验研究打下坚实的基础。1材料与方法1.1动物来源及分组健康Wistar大鼠由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，雌雄不限，体质量180250 g。动物分为阳性病毒组（实验组）、阴性病毒对照组和生理盐水对照组。1.2实验材料慢病毒包装细胞293T细胞株、大肠杆菌菌株DH5、及大鼠肝星状细胞株（HSCT6）均由上海吉凯基因技术有限公司提供；

10、慢病毒载体系统由pGCLV载体、pHelper1.0载体和pHelper2.0载体3种质粒组成。Taq多聚酶购自日本Takara公司；LB培养基购自美国ATCC公司；大量质粒DNA抽提试剂盒购自美国QIAGEN公司；限制性内切酶Age、EcoR、T4 DNA连接酶及其缓冲液均购自美国NEB公司；M-MLV逆转录酶、dNTP、RNA酶抑制剂均购自美国Promega公司；PCR用试剂、引物购自上海吉凯基因技术有限公司；胰酶购自上海化学试剂公司；胎牛血清、DMEM、RPMI1640及OptiMEM均购自美国GIBCO公司；脂质体Lipofect2000、总RNA提取试剂Trizol均购自美国Invi

11、trogen公司；山羊抗TFAM、小鼠抗GAPDH、抗山羊IgG、抗小鼠IgG均购自美国Santacruz公司；BCA Protein Assay kit购自美国HyClone-Pierce公司；ECL-PLUS/kit购自美国Amersham公司。1.3方法1.3.1构建慢病毒载体针对目的基因TFAM的基因序列，利用公用网站按照RNA干扰序列的设计原则，设计了4个siRNA的寡核苷酸序列（命名为target1#、target2# 、target3# 和target4#，具体序列见表1），并进行慢病毒载体的构建（双链DNA具体序列见表2），然后运用T4连接酶与经过限制性内切酶Age、EcoR双

12、酶切后的pGCLV载体连接，用氯化钙法制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞，转化大肠杆菌菌株DH5，最后挑取阳性克隆进行PCR鉴定并进行测序分析。PCR鉴定阳性克隆的引物信息如下：上游引物：5-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3，下游引物：5-GTAATACGGTTATCCACGCG-3。1.3.2慢病毒载体包装及滴度测定产毒细胞为293T细胞，将合成好的4个重组慢病毒质粒及辅助包装载体质粒进行高纯度无内毒素抽提，按照Lipofectamine2000使用说明共转染293T细胞。转染8 h后更换为完全培养基，48 h后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液进行浓缩和收获，将病毒浓缩液移出，分

13、装后保存在病毒管中，80 长期保存。取其中1支进行病毒生物学滴度测定，方法为孔稀释法。具体病毒浓缩收获及滴度测定实验步骤参考文献4。1.3.3慢病毒感染目的细胞HSCT6将处于对数生长期的靶细胞进行胰蛋白酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为2×104），接种于12孔培养板中，37 、5%CO2 培养箱培养待细胞融合度达到约30%；根据MOI值（MOI=10，MOI表示病毒数与细胞数量的比值），加入适宜量的病毒，12 h后观察细胞状态。如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24 h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基；感染3 d后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，感染效

14、率>50%者继续培养，待感染时间达到5 d后收集细胞抽提RNA进行RT-PCR检测实验，感染7 d后收集细胞并采用Western blot的方法检测目的基因蛋白水平的表达；感染效率<50%的实验组，重新进行感染实验。实验分为6组：CON为正常目的细胞，未感染任何病毒的细胞组，NC为正常目的细胞，加阴性对照病毒感染的细胞组，KD为正常目的细胞，加RNAi靶点病毒感染的细胞组，14标示待筛选靶点病毒的序号。1.3.4目的细胞中TFAM RNAi效果检测1.3.4.1RTPCR检测目的细胞TFAM mRNA水平表达的变化情况取各组细胞用Trizol法抽提总RNA，然后根据Promega反

15、转录试剂盒的操作说明将RNA反转录成cDNA。取1L作为模板进行PCR反应，TFAM上游引物：5-AGAAACGCCTAAAGAAGAAAGC-3，下游引物：5-TTCCAAGCCTGATTTACAAGC-3，扩增产物166 bp；内参照actin上游引物：5-CGGCATTGTCACCAACTG-3，下游引物：5-CGCTCGGTCAGGATCTTC-3，扩增产物约369 bp。PCR反应条件：预变性95 、15 s，之后每一步变性95 、5 s，退火延伸60 、30 s；共进行45个循环，每次在延伸阶段读取吸光度值。制作熔解曲线：PCR结束后，95 变性1 min，然后冷却至55 ，使DN

16、A 双链充分结合。从55 开始到95 ，每一步增加0.5 ，保持30 s, 同时读取吸光度值。Real-time PCR数值分析采用2-Ct分析法。1.3.4.2Western blot检测目的细胞TFAM蛋白水平表达的变化情况用2×Lysis Buffer（裂解液）冰上裂解细胞1015 min，裂解液配方如下：1 mol/L Tris-HCl（pH=6.8）100 mM、巯基乙醇 2、甘油20及SDS 4。测定蛋白浓度后，将每个样品蛋白终浓度均调整为2 g/L。各组取相同量总蛋白，采用SDS-PAGE电泳法电泳，湿转至PVDF膜，用含5脱脂牛奶的TBST溶液封闭PVDF膜，山羊抗T

17、fam抗体（1200）、小鼠抗GAPDH抗体（15 000）与封闭好的PVDF膜室温孵育2 h，TBST洗膜，相应二抗（15 000）室温孵育PVDF膜2 h，TBST洗膜，最后采用ECL法进行显色。利用图像处理软件Quantity one4.62对蛋白电泳图片进行分析，分别测定目的蛋白条带和内参照的吸光度值，并以二者的比值作为目的蛋白的相对定量结果。1.3.5大鼠活体RNAi动物模型的建立拟通过门静脉将慢病毒载体注入大鼠肝脏，为了保证慢病毒在大鼠体内的感染效率，我们在注射慢病毒之前进行了全肝血流阻断并参考文献5的做法将阻断时间定为20 min。具体方法如下：1）实验组大鼠腹部用8Na2S脱毛，手术野用碘伏消毒，整个手术过程在双人双目显微镜下操作。进行全肝血流阻断时，先结扎右肾上腺静脉，然后依次阻断肝后下腔静脉、肝动脉和门静脉的血流，全肝血流阻断后立即通过门静脉注射RNA干扰慢病毒载体（5×107 TU/只），阻断20 min后恢复血流。2）阴性病毒对照组和生理盐水对照组手术步骤基本上和实验组相同，不同的是门静脉分别注射的是阴性对照病毒和生理盐水。所有实验动物术前禁食12 h，麻醉采用乙醚吸入麻醉，术后自由进食水。各组观察时相点为术后4、7、14 d，保证每时相点每组存活