内皮素抗体在大鼠肾缺血再灌注损伤中的作用

1、内皮素抗体在大鼠肾缺血/再灌注损伤中的作用*摘要目的和方法：为探讨内皮素在肾缺血/再灌注损伤中的发病学意义，本实验在大鼠肾缺血/再灌注损伤模型上，观察了内皮素抗体对肾缺血/再灌注损伤的作用。结果：肾缺血/再灌注损伤大鼠，血清尿素氮(SUN)、肌酐(SCr)含量及血浆内皮素(PET)水平显著升高；脂质过氧化物丙二醛(MDA)产生增多；肾小管上皮细胞明显损伤。应用内皮素单克隆抗体能显著降低PET水平和MDA含量，减轻肾小管上皮细胞损伤，改善肾功能。结论：内皮素是参与肾缺血/再灌注损伤发病的重要因素之一，阻断ET的生物学作用是防治肾缺血/再灌注损伤的有效途径。主题词肾；局部缺血；再灌注；内皮缩血管肽

2、类；抗体 The role of ET-Ab in renal ischemia-reperfusion injury in ratsXIA Xiao-Hong, HE Rui-Rong*，SHEN Yu-Xue, SHI Ji-Cai, YU Zhan-JiuHebei Academy of Medical Sciences, Shijiazhuang (050021)*Hebei Medical University, Shijiazhuang Abstract AIM and METHODIn order to evaluate the possible role of ET-Ab in

3、 the pathogenesis of renal ischemia-reperfusion injury, the effect of ET-Ab on renal ischemia-reperfusion injury was investigated on a model produced by bilateral clamping the renal artery and vein followed by reperfusion in rats.RESULTS：Contents of SUN, SCr, MDA and level of plasma endothelin (PET)

4、 were significantly increased in renal ischemia-reperfusion injured rats, and the impairment of renal tubular epithelial cells was observed. ET-Ab might siginificantly decreased contents of SUN, SCr, MDA and level of PET, and attenuate the renal ischemia-reperfusion injury of rats.CONCLUSION：ET play

5、s an important role in the pathogenesis of ischemia-reperfusion injury. Blocking the biological actions of ET might be an effective means of preventing and treating ischemia-reperfusion injury.MeSHKidney; Ischemia, Reperfusion; Endothelins; Antibodies内皮素(endothelin,ET)是血管内皮细胞分泌和释放的一种血管活性多肽，是迄今已知体内作用

6、最强的缩血管物质1，研究表明，缺血性急性肾功能衰竭时，血浆内皮素水平明显升高，ET受体上调2，3。但也有研究认为，缺血性急性肾功能衰竭时肾小球ET受体无变化4。目前，有关ET在肾缺血/再灌注损伤中的作用及其机制尚不十分清楚。本工作应用内皮素单克隆抗体(ET-Ab)，观察其对大鼠肾缺血-再灌注损伤的作用，以进一步验证ET在肾缺血/再灌注损伤中的发病学意义，并探索有效的防治措施。材料与方法一、实验动物与分组：选用成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重220270 g(河北医科大学实验动物中心提供)，置于1822实验室安静饲养两日后随机分为3组，(1)缺血-再灌组(I-R，n=6)；(2)缺

7、血-再灌+ET抗体组(I-R+ET-Ab,n6)；(3)假手术组(Sham,n6)。二、药品与试剂：ET-Ab(Penisula Lab)；戊巴比妥钠(上海化学试剂采购供应站)；尿素氮，肌酐试剂盒(石家庄试剂厂)；PET放免药盒(解放军总医院东亚免疫技术研究所)；cGMP放免药盒(上海中医药大学)。三、实验程序：动物经2%戊巴比妥钠(ip)麻醉后，I-R+ET-Ab组开腹暴露双侧肾动静脉，于夹闭肾动静脉前5 min，尾静脉注射ET-Ab(5 L/100 g体重，110万单位)，夹闭双侧肾动静脉60 min后恢复灌流，逐层缝合腹膜、腹壁肌肉和皮肤，关闭腹腔；I-R组尾静脉给予等量生理盐水，余操作

8、同I-R+ET-Ab组；Sham组手术操作亦同I-R+ET-Ab组，尾静脉给予等量生理盐水，但不夹闭肾动静脉。再灌注后24 h取腹主动脉血5 mL分别测定血浆内皮素(PET，放免法)，血清尿素氮(SUN，二乙酰-肟法)，血清肌酐(SCr，苦味酸法)及血清丙二醛(MDA，硫代巴比妥酸法)，取血后迅速摘取左侧肾脏，于冰板上切取同一部位肾组织，速冻于低温冰箱内待测cGMP，余固定于福尔马林溶液中待做病理形态学观察。四、统计处理：所有数据以均值标准差()表示，采用组间均值t检验判定差异显著性。结果一、ET-Ab对肾缺血-再灌注损伤大鼠SUN和SCr的影响(表1)：表1ET-Ab对肾缺血/再灌注损伤大鼠

9、血清尿素氮和肌酐的影响Tab 1Effects of ET-Ab on contents of SUN and SCr in the renal I-R rats(,n=6)TreatmentSUN(mmol/L)SCr(mol/L)Sham7.061.4962.7610.61I-R25.853.25*130.8031.82*I-R+ET-Ab12.881.87*85.7415.03*P0.05，*P0.01，vs sham group；P0.05，P0.01，vs I-R group肾缺血-再灌注损伤大鼠SUN和SCr值明显高于Sham组，而I-R+ET-Ab组大鼠SUN和SCr升高幅度明显

10、低于I-R组（P0.05，P0.01)。二、ET-Ab对肾缺血-再灌注损伤大鼠cGMP和MDA的影响(表2)：表2ET-Ab对肾缺血/再灌注损伤大鼠cGMP和MDA含量的影响Tab 2Effects of ET-Ab on contents of cGMP and MDA in the renal I-R rats (，n=6)TreatmentcGMP(pmol/mg WW)MDA(mol/L)Sham0.210.0323.863.16I-R0.100.03*43.381.66*I-R+ET-Ab0.220.0531.632.78* *P0.01，vs sham group;P0.01，vs

11、 I-R groupI-R组大鼠肾组织cGMP明显低于Sham组，I-R+ET-Ab组与Sham组无显著差异，但明显高于I-R组。I-R组大鼠血浆MDA含量明显高于Sham组，而I-R+ET-Ab组MDA升高幅度则明显低于I-R组(P0.01)。三、ET-Ab对肾缺血-再灌注损伤大鼠PET的影响(1)：1ET-Ab对肾缺血-再灌注损伤大鼠血浆ET水平的影响I-R组大鼠PET水平明显高于Sham组(P0.01)，I-R+ET-Ab组PET含量却明显低于I-R组和Sham组(P0.01)。四、ET-Ab对肾缺血-再灌注损伤大鼠肾小管上皮细胞损伤程度的影响(2)：Sham组肾组织形态学观察未发现明显

12、异常，I-R组近曲小管呈现弥漫性脂肪变性，伴有较多灶性坏死区。远曲管和集合管内有大量蛋白管型。肾球囊内尚可见到蛋白渗出物。I-R+ET-Ab组病变明显轻于I-R组，仅出现部分近曲管上皮细胞浊肿，少数细胞空泡变性，部分远曲管和集合管内有少量蛋白管型，肾小囊内未见蛋白渗出物。讨论肾脏是对缺血/再灌注损伤非常敏感的器官5，以往研究表明，肾缺血/再灌注损伤的发生机制与氧自由基所致的脂质过氧化物损伤密切相关6，但确切发病机制至今未明。近年发现，肾血管内皮细胞生成和释放的收缩(ET等)和舒张(NO等)因子失调对于肾缺血/再灌注损伤具有重要的发病学意义7，8。ET是迄今已知体内最强的缩血管物质，组织缺血缺氧

13、可使血管内皮细胞受损，ET产生和释放增多，ET又可进一步使肾血管收缩，加重肾组织缺血缺氧。如能阻断ET的生物学效应，将改善肾内血流动力学状态、减轻肾缺血/再灌注损伤。本实验观察到，夹闭大鼠双侧肾动静脉60 min再灌24 h后，肾功能明显受损，SUN、SCr、 PET水平均明显高于假手术组，应用ET-Ab能明显降低SUN、SCr及PET含量，减轻肾小管上皮细胞损伤，改善肾功能。实验结果进一步证实，ET参与肾缺血/再灌注损伤的发病过程，而ET-Ab可通过中和体内过多的ET，起到拮抗和阻断ET的生物学效应，改善肾内血流动力学，减轻肾损伤的作用。研究发现9，夹闭大鼠双侧肾动脉45 min再灌注5 m

14、in后，PET即开始升高，5 h时达最高值，20 h时PET恢复正常，认为PET增加只在ARF初期起作用，而我们于再灌注24 h时测得的PET水平仍维持在较高水平，这可能是由于模型制做方法不同所致。以往研究证实，氧自由基所致的脂质过氧化物损伤与肾缺血/再灌注损伤的发病有密切关系。我们在实验中观察到，肾缺血/再灌注损伤后，脂质过氧化物MDA产生增多，肾小管上皮细胞变性坏死。而应用ET-Ab后，可明显降低MDA含量，减轻肾小管上皮细胞损伤。研究表明，ET通过促进胞内钙释放和胞外钙内流，使胞内钙超载，进而发挥其生物学作用10。因此，我们认为，ET-Ab阻断ET的生物学作用，减轻胞内钙超载，一方面避免

15、了由于胞内高钙引起的ATP降解，黄嘌呤氧化酶生成和磷脂酶激活，减少了自由基的来源；另一方面保护了线粒体功能及超氧化物歧化酶(SOD)，使氧自由基能迅速清除。这可能也是ET-Ab改善肾内血流动力学，减轻肾缺血/再灌注损伤的原因之一。cGMP对肾功能的有益作用已被证实。本实验观察到，ET-Ab组cGMP水平较I-R组明显增加，这可能对改善肾功能，减轻肾缺血/再灌注损伤也起到了积极的作用。*河北省自然科学基金资助(No.395420)作者单位:夏晓红申玉学石纪才于占久河北省医科院实验医学研究所(石家庄 050021)何瑞荣河北医科大学基础医学研究所参考文献1Yanagisawa M, Kurihar

16、a H, Kimura S, et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature, 1988,332:411.2Lopez-Farre A, Gomez-Garre D, Bernabeu F, et al. A role for endothelin in the maintenance of post-ischaemic renal failure in the rat. J Physiol (Lond), 1991,444:513. 3Nambi P, P

17、ullen M, Jugus M, et al. Rat kidney endothelin receptors in ischemia-induced acute renal failure. J Pharmacol Exp Ther, 1993,264:345.4Wilks BM, Peal AR, Mento PF, et al. Glomerular endothelin receptors during initiation and maintenance of ischemic acute renal failure in rats. Am J Physiol, 1991,260:

18、(1 pt2)F110.5戴龙君，李宏英，丁鼎武.自由基与缺血性肾脏损伤.国外医学泌尿系统分册，1986，3：3.6尹明，高治忠.氧自由基与肾缺血/再灌注损伤.国外医学泌尿系统分册，1988，5：217.7Chan L, Chittinandana A, Shapiro JI, et al. Effect of an endothelin-receptor antagonist on ischemic acute renal failure. Am J Physiol, 1994,266:F135.8C. Caramelo G, Espinosa F, Manzarbeitia MR, et al. Role of endothelium-related mechanisms in the pathophysiology of renal ischemia/reperfusion in normal rabbits. Circ Res