反硝化微生物分子生态学技术及相关研究进展-

1、反硝化微生物分子生态学技术及相关研究进展孙建光1,2,高俊莲3,马晓彤1,2,徐晶1,2,姜瑞波1,2(11农业部植物营养与养分循环重点实验室,北京100081;21中国农业科学院农业资源与农业区划研究所,北京100081;31北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心,北京100089摘要:反硝化是微生物以氮氧化物作为电子受体产生能量的过程。由微生物推动的反硝化使地球生物圈中被固定的氮素重新回到大气中去,从而实现整个自然界的氮素循环。反硝化作用与人类的生产、生活密切相关,它能使江河湖海脱除氮素富营养化而得以净化,也能使农田氮肥反硝化流失造成重大经济损失。多年来,基于培养技术的传统微生物研究方法

2、很难了解环境中的反硝化微生物,因为人们目前能够培养的微生物不足环境微生物总量的3%。近年来,分子生物学和现代生物技术的迅猛发展极大地推动了环境微生物学的发展,人们可以直接提取环境DNA 、通过分子标记和多种技术研究环境微生物。本文综述了环境反硝化微生物的分子生态学研究技术及国内外相关领域的研究进展。关键词:反硝化微生物;分子生态学;分子标记;研究进展中图分类号:S154136;Q93811文献标识码:A 文章编号:1673-6257(200702-0007-06收稿日期:2006-03-30基金项目:农业部植物营养与养分循环重点实验室基金、教育部留学回国人员基金、北京市自然科学基金、国家自然科

3、技资源平台项目资助。作者简介:孙建光(1963-,男,博士,副研究员,研究微生物资源与利用。高俊莲为通讯作者。反硝化在传统意义上被定义为某些细菌在无氧或微氧条件下以NO 3-或NO 2-作为电子受体进行呼吸代谢获得能量,同时将NO 3-或NO 2-还原为N 2O 或N 2的过程。近些年来,科学研究发现某些真菌和放线菌,甚至酵母菌也具有反硝化作用,而且有的微生物在好氧条件下也能进行反硝化作用。2002年,法国学者Philippot 为反硝化作了一个简洁的定义:反硝化是微生物以氮氧化物作为电子受体产生能量的过程1。由微生物推动的反硝化作用是自然界氮素循环的一个重要环节,地球生物圈中被固定的氮素通过

4、反硝化作用重新回到大气中去,从而实现整个生物圈的氮素循环。反硝化作用与人类的生产、生活密切相关,作为有利的方面,它使江河湖海脱除氮素富营养化而得以净化;作为不利的一面,它使农田反硝化脱氮造成重大经济损失。对江河湖海的富营养化治理从源头上控制是第一重要的,但对于已经造成的污染如氮素富营养化问题,则要靠水体的自体净化和必要的人为措施,微生物反硝化作用是自然界江河湖海实现自体净化的主要途径。治理地下水硝酸盐污染关键在于治理地表水的氮素富营养化,最有效的途径之一是通过微生物反硝化脱氮。研究我国江河湖泊以及农田反硝化微生物,对治理水环境污染、改善我国城镇居民饮用水质量、以及减少农田氮肥损失具有重要意义。

5、1我国的水体富营养污染、农田氮肥损失及其与反硝化微生物的密切关系我国的江河湖海水体富营养化严重,水环境治理耗资巨大。20世纪70年代以来,随着我国人口的迅速膨胀,农业集约化程度的高速增长,我国许多地区的湖泊、河流和近海海域都出现了不同程度的污染,水体的氮素富营养化问题急剧恶化2。太湖、巢湖已进入富营养化状态,水质总氮指标等级已达劣五类3。洪泽湖、洞庭湖、鄱阳湖和一些主要的河流水域如淮河、汉江、珠江、葛洲坝水库、三峡库区也同样面临着富营养化的威胁。根据世界银行和中国有关专家的研究,水污染在中国造成的经济损失约占G DP 的1146%2184%4,“十五”期间用于包括水污染治理的环境整治的投资规划

6、为7000亿元,已达到中国G DP 的1%5。城市地下水是重要的饮用水资源,目前地下水硝酸盐污染已经对城市的饮用水安全造成了威胁。如北京市约50%饮用水资源取自地下水,据北京市环保局对7205眼水源井的抽样监测,地下水硝酸盐超标率2314%,硝酸盐超标面积14618km2,硝酸盐已经成为北京地区地下水两种主要污染物之一6。中国农业科学院在北京、山东、陕西、河北、天津等地20个县600多个点位的抽样调查显示,在北方集约化的高肥用量地区20%地下水硝酸盐含量(NO3-超过89mgL-1(中国饮用水硝酸盐含量限量标准,45%地下水硝酸盐含量(NO3-超过50mgL-1(主要发达国家饮用水硝酸盐含量限

7、量标准,个别地点硝酸盐含量(NO3-超过500mg L-17,地下水硝酸盐污染将对上亿人口的饮用水质量安全造成威胁。我国农田反硝化脱氮损失严重,研究数据表明我国农田化肥氮素通过不同损失途径进入环境的氮量每年约为1300万t,其中进入地表水125万t,进入地下水50万t,硝化和反硝化损失850万t,氨挥发损失275万t(朱兆良,私人通讯。,地下水硝酸盐富集,以及大气N2O的主要来源之一,已受到世界关注。稻田氮循环研究表明由反硝化微生物所引起的反硝化作用是土壤、湿地中氮素流失的主要原因,以分子态氮气进入大气。2研究环境反硝化微生物的分子生态学方法反硝化微生物是一个生理类群,广泛分布于土壤、淤泥、水

8、体等自然环境。在分类单元上主要分布在P seudomonaceae、Neisseriaceae、Nitrobacter2 aceae、Rhodospirillaceae、Bacillaceae、Cytophagaceae、Spirileaceaee、Rhizobiaceae、Halobacteriaceae等科8。传统理论认为反硝化微生物均为细菌,在嫌气条件下进行反硝化作用。1991年Shoun等发现Fusarium oxysporum在厌氧条件下可以把硝酸盐和亚硝酸盐还原成N2O,从而打破了这一传统观念9。后来发现反硝化过程广泛存在于真菌的半知菌纲、子囊菌纲和担子菌纲;很多放线菌10包括链霉

9、菌属11和Frankia属12,甚至一些酵母菌也有反硝化能力。另一个发现是在好氧条件下也存在反硝化作用13,如粪产碱菌(Alcaligenes f aecalis和脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans能同时利用氧气和硝酸盐作为电子受体进行产能代谢。反硝化是微生物以氮氧化物作为电子受体产生能量的过程,这个过程由4步反应组成,把硝酸盐还原为分子态氮气,反应式为:NO3-NarNO2-NirNON orN2ON osN2催化这4步反应的酶分别是硝酸还原酶(ni2 trate reductase、亚硝酸还原酶(nitrite reductase、氧化氮还原酶(nitric ox

10、ide reductase和氧化亚氮还原酶(nitrous oxide reductase,它们相应的编码基因分别称为nar、nir、nor和nos7。其中亚硝酸还原酶基因nirK和nirS催化反硝化过程中最关键的一步反应,由亚硝酸盐转化为氧化氮的反应,是反硝化微生物最为重要的功能基因。微生物被认为是地球生物圈最重要的构成元素,在物质循环中起着关键作用。在过去的1520年中,微生物生态学发生了革命性的发展。由于微生物分子生物学的成就,人们不必进行微生物的分离培养和大量的性状测定就可以快速地直接从自然界获得未培养微生物的基因及其序列,并且可以根据微生物功能基因序列分析迅速鉴定微生物、分析微生物之

11、间的系统学进化关系。具体到反硝化微生物及其基因资源多样性研究领域,分子生物学技术及由此推动的研究新进展表现在下列几个方面:211RF LP技术用于研究环境反硝化微生物多样性。限制性片段长度多态性RF LP(restriction frag2 ment length polym orphism是研究环境反硝化过程基因多样性的有力工具。1998年美国Braker实验室通过序列比较和反复试验,研究出了可以用来扩增亚硝酸盐还原酶nirK和nirS基因特异性片段的引物,找到了通过PCR(P olymerase chain reaction,聚合酶链式反应扩增nirK和nirS基因的方法。他们成功地从Bl

12、astobacter denitrificans、Alcaligenes xy2 losoxidans和Alcaligenes sp1DS M30128扩增到了nirK 基因,从Alcaligenes eutrophus DS M530和IFAM3698扩增到了nirS基因。并且在沼泽地的实地使用证明这一方法可以定量检测沼泽环境反硝化细菌的nirK和nirS基因14。之后,Braker研究小组用RF LP和DNA杂交技术分析了华盛顿海岸沉积物中反硝化微生物nirS基因多样性,系统学分析显示这些新分离的nirS基因聚类为独立的分类单元,不同于已知的可培养反硝化细菌的nirS基因序列15。美国密执

13、安大学对森林和沼泽地反硝化微生物nirK和nirS基因进行的RF LP分析表明,nirS 较nirK更具遗传多样性,而且发现了许多未曾报道过的nirS基因序列16。M ounier等用RF LP对738个硝酸还原酶基因narG克隆和713个氧化亚氮还8原酶基因nosZ克隆进行了聚类分析,研究玉米根际的反硝化微生物narG和nosZ基因多样性。结果表明narG与来源于Actinomycetales的narG序列有相关性,而nosZ与Proteobacteria的nosZ相关,而且多数新检测到的基因属于未培养微生物17。以nirS基因为分子标记进行的末端限制性片段长度多态性T-RF LP(term

14、inal restriction fragment length poly2 m orphism分析显示,西南太平洋地区水体环境中O2、NO32、NO22是决定反硝化菌群群体结构和nirS 基因多样性的主要影响因素18。美国Rutgers大学的研究人员,曾经采用T-RF LP技术研究了新泽西州Tuckerton地区大陆架沉淀物中反硝化细菌nosZ基因多样性随时空变化规律19。212DGGE技术研究反硝化微生物nirK、nirS、nosZ基因多样性变性梯度凝胶电泳DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis也被成功地用来研究反硝化过程的相关基因。瑞典学

15、者用DGGE研究环境中nirS, nirK和nosZ基因多样性,实验表明用DGGE分析nirK和nosZ基因效果很好,同时发现农田土壤中存在很强的nirS基因多样性20。Enwall等采用DGGE和RF LP研究长期施用有机和无机肥料对土壤nosZ和narG基因多样性的影响,并且采用核糖体基因间序列分析RIS A(ribos omal intergenic spacer region analysis来分析全部根际微生物21。华裔学者也曾以亚硝酸盐还原酶基因nirS和nirK为分子标记,结合RF LP和DGGE分析来分析反硝化细菌的多样性22。nirK和nirS基因还被用来分析太平洋地区墨西哥

16、海岸淤泥的反硝化微生物区系和种群结构,44个nirS基因相互之间的序列相似性为52%92%,其中26%的nirS基因与Alcaligenes f aecalis和P seudomonas stutzeri的nirS基因有高同源性(80%99%相似性;31个nirK基因相互间的序列相似性在50%99%,其中约31%的nirK基因与P seudomonas sp1G-179(98%99%、Bradyrhizobium japonicum(91%、Blastobacter denitrif2 icans(83%和Alcaligenes xylosoxidans(96%紧密相关23。Y oshie等对

17、硝酸盐废水处理系统反硝化细菌nirK和nirS基因多样性的调查显示高盐度显著降低该基因的多样性24。213反转录PCR及定量PCR技术研究环境反硝化微生物Sharma等自豆科植物根际直接提取土壤mRNA,用反转录PCR(RT-PCR,reverse transcription PCR技术分析亚硝酸还原酶nirK和nirS基因在根际土壤的分布,从而分析豆科植物根际的反硝化微生物。结果在所有样品中均检测到了nirK基因,但没有检测到nirS基因。采用RF LP和DGGE进一步分析显示豆科植物根际的反硝化微生物种群随植物的品种而显著变化25。英国学者从C olne河底沉积物中提取mRNA,通过反转录

18、PCR(RT-PCR表达分析了5个反硝化基因硝酸还原酶(narG和na2 p A、亚硝酸还原酶(nirS和nirK和氧化亚氮还原酶(nosZ,检测到了nirS和nosZ基因的mRNA,但未检测到其它基因26。Henry等以nirK为目标基因,开发出了用real-time PCR技术定量分析土壤中反硝化细菌的方法27,这一方法可以线性测定土壤环境中107以内nirK基因,灵敏度达到102。结果显示被测土壤样品的nirK基因数量在917104至319106拷贝每克土样。对56个nirK基因序列系统学分析,显示多数基因序列与目前已知的可培养反硝化微生物的nirK基因序列不同。G rntzig等以P

19、seudomonas stutzeri的nirS为目标基因设计引物,用real-time PCR技术对环境样品中的反硝化细菌进行定量分析,结果显示目标基因在1到106拷贝的范围内定量测定均为线性关系(r2= 01999,用此方法可以准确测定环境中的P seu2 domonas stutzeri基因nirS丰度28。214G C-FAME、FISH及16S rRNA技术研究反硝化微生物遗传多样性Wang和Skipper采用脂肪酸甲基酯色谱分析(G C-FAME,chromatography fatty acid methyl ester和16S rDNA序列分析鉴定了草坪根际的反硝化微生物29,

20、主要的反硝化微生物类群为Bacillus和P seudomonas。两种方法的一致性可以达到60%。分别在74%和15%的反硝化微生物中检测到了亚硝酸还原酶基因nirK和nirS,在全部反硝化微生物中都检测到了氧化亚氮还原酶基因nosZ。在非反硝化微生物中没有检测到nirK和nirS,但检测到了nosZ基因。荧光原位杂交(FISH,Fluorescence in situ hybridization技术也被用来检测活性污泥中的反硝化微生物,证明优势微生物为Beta-proteobac2 teria30。此外,16S rRNA(rDNA的全序列被用来分析污水处理厂活性污泥中的细菌群体结构,并且被

21、克隆到p GE M-T载体上进行荧光标记样品的原位杂交,结果显示活性污泥中的优势菌群是-9Proteobacteria31。G omez-Villalba等用PCR扩增了16S rRNA基因部分序列,然后用温度梯度凝胶电泳(TGGE,tem perature-gradient gel electrophoresis分析了郊区污水厂生物处理膜上的微生物种群多样性。对氧化亚氮还原酶基因nosZ和氨单氧酶(am2 m onia m onooxygenaseamo A基因的分析显示在水处理系统的有氧区和无氧区均存在反硝化细菌和氨氧化细菌,而且在1年的观察期内,该微生物种群在时间和空间上的分布保持相对稳

22、定32。3国内反硝化微生物相关领域的研究概况在反硝化微生物的基因组研究领域,我国学者鉴定了P seudomonas stutzeri A1501基因组中与反硝化相关的4个基因组,包括nar、nir、nor和nos 在内共计40个基因,它们分别编码物质运输、基因调控和反硝化过程的还原酶33。在反硝化微生物的生理生化方面,张光亚等从土壤中分离到一株好氧并且同时具有硝化和反硝化作用的细菌34。该菌为革兰氏阳性、球状或杆状、菌落橙红色,以硝酸钠为氮源时能进行好氧反硝化作用;以乙酸钠和硫酸铵为碳源和氮源时能进行异养硝化作用,能以乙酰胺为唯一碳源和氮源生长。16S rDNA部分序列分析表明该菌与Rhodo

23、coccus ruber的16S rDNA 序列具有99%相似性。傅利剑等研究了碳源及碳氮比对P seudomonas alcaligenes HP1异养反硝化能力的影响,试验表明碳源种类对硝酸还原酶活性没有明显影响,但对氧化亚氮还原酶活性有影响;当最适C/N为8时,菌株HP1利用NO3-作为唯一氮源进行反硝化35。张玉芹等从45个反硝化细菌菌株中筛选出具有较强反硝化能力的菌株B88和B237,并测定了最适培养基、生长温度、好气性和反硝化能力36。环境反硝化微生物种群结构研究方面,王国祥等用最大可能数(MPN,M ost Probable Num2 ber法测定了太湖及各种生态类型水生高等植物

24、群落内的反硝化细菌的分布,并探讨了它们的作用37。结果表明在水生高等植物群落内水体中反硝化细菌的最大可能数较湖区高25个数量级,反硝化细菌在水生植物根际最为密集。凤眼莲、水花生覆盖下的水样反硝化产气量分别为敞水区的612和418倍,表明有水生高等植物生长的水体氮素容易释放进入大气。闵航等在实验室条件下研究了黄松稻田土壤、紫色稻田土壤和红壤稻田土的反硝化细菌种群数量及其反硝化活性38。结果为紫色稻田土壤和红壤稻田土的反硝化细菌种群数量分别为(59104157159104cfu/g干土和(32114 75130104cfu/g干土。陈中云等在实验室条件下研究了Cd2+、As5+、Cu2+和Pb2+

25、重金属污染对黄松稻田土、紫色稻田土和红壤稻田土反硝化细菌种群数量及其反硝化活性的影响39,表明在1 kg干土中加入015mg Cd2+、30mg As5+、50mg Cu2+和200mg Pb2+时,对稻田土反硝化细菌种群数量及其活性有促进作用,加入Cd2+、As5+、Cu2+和Pb2+分别超过110、60、500、400mg/kg干土时,对稻田土反硝化细菌种群数量及其活性有明显抑制作用。反硝化清除水体污染方面,孔庆鑫等利用间歇曝气富集和氰化钾筛选技术,选到一株以柠檬酸钠为碳源、以硝酸钾为氮源进行好氧反硝化的细菌,定名为P seudomonas sp1Y2-1-1。该菌在溶氧910015mg/

26、L的培养基中5d内可将硝态氮由28210 mg/L降至14912mg/L,同时仅有少量亚硝态氮积累40。周丹丹等采用污泥富集、T N法初筛和氮元素轨迹跟踪复筛的方法得到25株对T N去除率达到50%以上的好氧反硝化细菌41。李平等从稻田土壤中分离到一株好氧反硝化细菌HS203,能有效去除人工废水中的NO3-,不形成NO2-积累42。16S rDNA序列及生理生化特征分析表明HS203是P seu2 domonas的一个新种。传统理论认为反硝化细菌是异养厌氧菌,上世纪80年代发现了好氧反硝化细菌。近年来自养反硝化细菌的发现,特别是脱氮硫杆菌的发现引起了人们的广泛关注。反硝化除磷能够实现以相同的基

27、质同时脱氮和除磷,是国外废水生物处理研究的一个热点。曹长青等研究了NO3-、溶氧、pH、NO2-等因素对反硝化除磷的影响,为反硝化除磷的实际应用提供了参考依据43。水产养殖中氨氮和亚硝态氮的存在对许多水产动物如鱼、虾有一定的毒害作用。传统上采用活性污泥直接投入或者采用固定化光合细菌来进行水产养殖脱氮,但效果都不够理想。由于在虾等特产高密度养殖过程,必须连续的充氧来保证水中一定的溶解氧,厌氧反硝化细菌的反硝化作用不能充分发挥。于爱茸等从塘水中分离到1株高效有氧反硝化菌,经鉴定为芽孢杆菌,在溶氧2mg/L时除氮率达97%,溶氧达到45mg/L仍有反硝化作用,除氮率为85%以上44。与典型的好氧反硝

28、化菌P seu2 domonas stutzeri相比,该菌有更强的耐溶氧能力,1在好氧条件下、菌体浓度为1000个/m L时,对自然水体中高达1mg/L亚硝酸浓度能发挥高效的反硝化作用。同时还分析了水体中不同溶解氧、有机碳源、温度、pH、菌体浓度等因素对该菌反硝化作用的影响,为水产养殖生物除氮探索了更为高效、经济的水质改良方法。参考文献:1Philippot L.Denitrifying genes in bacterial and Archaeal genomesJ.Biochimica Biophysica Acta(BBA-G ene Structure andExpression,2

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48、ora2 AO nitrogen fertilizer from fields1 For many years , people know very little about denitrifiers in natural environment because of the limi2 Key words : denitrifier ; molecular ecology ; molecular mark ; research progress development of environmental microbiology1 People can extract DNA directly from environment and study environmental microbes trification can benefit people by remediation of nitrogen polluted water system and in the opposite can cause great loss by