合成致死作用

1、所谓合成致死作用，是指通过治疗药物和致癌基因的协同作用杀灭肿瘤。这是一种治疗肿瘤的间接但有效方式。分子靶向治疗肿瘤的意义在于选择性地杀灭肿瘤细胞而不伤害正常组织。这就需要明确在肿瘤细胞中异常活化的致病通路，并针对性地将其阻断。由于很多致癌信号通路都涉及到转录因子的异常活化，小分子抑制剂很难直接起到阻断作用。一种替代策略就是靶向阻断某种细胞生存增殖的基本过程，例如细胞周期。在正常细胞中，这仅仅导致细胞周期停滞；而在肿瘤细胞中，由于存在特殊的致癌通路活化，这一手段会诱发肿瘤细胞死亡，即合成致死作用（synthetic lethal cooperation）。所谓合成致死作用，是指通过治疗药物和致癌

2、基因的协同作用杀灭肿瘤。这是一种治疗肿瘤的间接但有效方式。举例说明，原癌基因MYC编码一个多效性转录因子，在正常情况下，通过调控多达10000余种基因的表达影响细胞的生长、增殖和分化等生理过程。然而，MYC基因的过度表达则与基因不稳定性、肿瘤发生、细胞凋亡等相关，所以，合成致死作用在MYC过表达肿瘤的治疗中起到关键作用。抑制CDK1作为治疗MYC过表达肿瘤的潜在方式细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）是一组协调细胞周期进程的蛋白激酶。CDK1和CDK2通过与细胞周期调节蛋白（Cyclin）形成不同的复合物，在哺乳动物细胞周期调节中起到关键作用。其中，CDK1更是与细胞分裂关系密切，CDK1 与cy

3、clin B 形成的复合物在有丝分裂早期的纺锤体形成、染色体聚集、协调染色体分离等步骤中起到重要作用。已知有小分子抑制剂能靶向抑制CDK1功能，使正常细胞的细胞周期停滞于G2期。而我们的研究显示，在MYC基因过度表达的肿瘤细胞中抑制CDK1功能，会特异性诱发细胞凋亡。研究使用了CDK1选择性抑制剂purvalanol，与人视网膜色素上皮细胞（RPE）共同孵育24小时后，有40%60%细胞的细胞周期停滞于G2期。为了研究合成致死作用，我们在Rat1细胞系中表达了作用机理不同的癌基因（MYC、E2F1、E2F3、活化NOTCH1、ID1、活化AKT、BCR/ABL 和活化HRAS等），并使用pur

4、valanol处理。结果显示，在暴露于purvalanol 之后，只有过度表达MYC 基因的Rat1 细胞系发生了细胞大量死亡的现象。同样的现象也可在过度表达MYC基因的RPE细胞系中观察到。值得注意的是，purvalanol与MYC基因的合成致死作用与p53 无关。但是，当MYC 和BCL2 基因同时表达时，purvalanol所诱导的凋亡被完全阻断，细胞周期停滞于G2期。这一现象提示，线粒体凋亡途径介导了这一合成致死作用。在人类的肿瘤细胞系中，我们也观察到了类似现象。那些已知高表达MYC基因的肿瘤细胞系（DAUDI、RAMOS、RAJI以及多发性骨髓瘤和小细胞肺癌细胞系等），对purval

5、anol非常敏感，且其敏感性与MYC基因表达水平呈正相关。最后，我们在两项体内试验中验证了CDK1抑制剂与MYC的合成致死作用。首先，我们将MYC 过表达淋巴瘤细胞注入C57B/6小鼠腹膜腔内，在肿瘤形成后，小鼠开始接受7 天的urvalanol 腹腔注射治疗20 mg/（kg·次）。结果发现，治疗组小鼠比对照组小鼠的生存期显著延长（41天对30天，P=0.0026）。之后，我们又使用了MYC转基因小鼠肝癌模型。在这种小鼠模型（Tet-o-MYC/LAP-tTA）中，MYC 的表达被食物中的多西环素（doxycycline）所抑制。在停止在食物中添加多西环素3周后，由于MYC 基因高

6、表达，Tet-o-MYC/LAP-tTA 小鼠的肝脏中逐渐形成肿瘤病灶。我们的试验发现，在治疗3周后，几乎所有对照组小鼠均发生了肉眼可见肝脏肿瘤（4 mm），而purvalanol治疗组20 mg/（kg·次）小鼠肿瘤发生率较对照组显著减少（见图）。       在这项研究中，我们证实了过度表达MYC 基因与CDK1 抑制剂的合成致死作用。临床前数据证实了CDK1抑制剂的强大治疗作用。同时提示，过度表达MYC基因可以作为筛选CDK1抑制剂敏感肿瘤的生物标志物。Aurora-B 激酶抑制剂与MYC癌基因的合成致死作用染色体乘客蛋白复合物（chro

7、mosomepassenger protein complex，CPPC）由极光激酶B（aurora-B）、survivin、INCENP 和borealin等蛋白组成。CPPC的功能涉及细胞分裂过程的多个方面，包括纺锤体检测点、染色体分离、细胞质分裂等。VX-680是一种小分子抑制剂，可有效且可逆地抑制CPPC的催化亚基aurora-B。我们的研究发现，异位过表达MYC基因的RPE 细胞系（RPE-MYC）在暴露于VX-680（300 nM）79 天后，细胞会全部死亡。值得注意的是，即使是在暴露的第3天停用VX-680，RPE-MYC 细胞仍会继续死亡过程。相反地，对照组RPE 细胞系（RP

8、E-NEO）暴露于VX-680 时，仅会停止细胞增殖；当VX-680被洗脱后，细胞会继续增殖。AB       在暴露于VX-680 3 天后，有30%的RPE-MYC 细胞死亡，而此时，几乎所有的存活细胞均表现为多核与多倍体表型，并进入一个新的死亡阶段。由此，我们将VX-680 的作用分为两个阶段，分别为“早期”阶段（3天之内）和“延迟”阶段。我们的研究进一步证实，在早期阶段，细胞凋亡相关蛋白Bim以及活化caspase-9水平显著升高，提示此时VX-680所致RPE-MYC细胞死亡由经典的细胞凋亡路径介导；而当存活RPE-MYC细胞进入延迟阶段后，开

9、始表现出自体吞噬的特征，如电镜下可见自噬空泡（autophagic vacuoles）、局部细胞质降解（localized cytoplasmic degeneration）等（上图），使用RNAi或基因敲除等方法抑制细胞自噬途径相关蛋白（如Atg5、Atg6、Atg7等）可阻止延迟期细胞死亡，提示在这一阶段，RPE-MYC细胞死亡是经由细胞自噬过程介导的。根据研究结果，我们推测出MYC 和VX-680 合成致死作用的分子学途径：首先，VX-680通过抑制CPPC（aurora-B）阻止细胞质分裂；进而过度表达的MYC 导致G1/S检测点失效，而VX-680阻断纺锤体检测点；随之而来的是非正常

10、的DNA合成过程，细胞出现多核和多倍体表型。在这个过程中，MYC介导了即时（早期）的细胞凋亡过程，而MYC 和VX-680 共同通过ATG蛋白途径诱导了细胞自噬的延迟死亡过程。之后，我们又通过体内试验，验证了VX-680与MYC的合成致死作用。同基因小鼠（isogenic naive mice）被移植入高表达MYC 基因的淋巴瘤细胞（ 来源于Tet-o-MYC/E-SR-tTA转基因小鼠），7天后小鼠开始接受VX-680治疗，治疗采取间歇脉冲方式给药，结果发现，相较于对照组，治疗组小鼠的生存期延长3倍。在这项研究中，我们证实了VX-680与过表达MYC间的合成致死作用，由此，过表达MYC可以作

11、为筛选VX-680敏感肿瘤的生物学标志物。此外，在VX-680与过表达MYC的合成致死过程中，细胞的死亡过程呈现双阶段，依靠不同细胞途径介导，可以有效避免耐药的产生。同时，间歇脉冲式给药方式可以有效降低治疗毒性。谷氨酰胺缺乏诱发MYC介导凋亡癌细胞和正常细胞在基础营养物质代谢方面的差异，一直被认为可成为肿瘤治疗的潜在靶点。癌细胞的生长、增殖消耗大量葡萄糖和谷氨酰胺。研究证明，谷氨酰胺在肿瘤细胞中的转运速度要高于正常细胞，而谷氨酰胺酶的活性与肿瘤细胞的生长速度相关，部分肿瘤细胞系依赖谷氨酰胺或其代谢产物生存。谷氨酰胺 +谷氨酰胺 -    Yuneva等人的研究显示，在过表达

12、有功能MYC（MYC ON）的细胞中，去除培养基中的谷氨酰胺可诱导细胞凋亡（上图）。而在过表达无功能MYC（MYC OFF）的细胞中，这一措施不能达到同样效果。由于这一过程可被丙酮酸或草酰乙酸所逆转，谷氨酰胺剥夺可能是通过影响细胞的三羧酸循环而诱发细胞凋亡。这一研究结果提示，MYC过表达与谷氨酰胺缺乏也可能存在合成致死作用。对于MYC 过表达并依赖谷氨酰胺生存的肿瘤，谷氨酰胺酶抑制剂有可能成为有效的靶向治疗药物。到目前为止，已经有5条不同的途径被发现可与过表达MYC协同作用，引发肿瘤细胞的合成致死作用。包括DR5、抑制Cdk1（Purvalanol）、抑制CPPC（VX-680）、谷氨酰胺剥夺

13、、抑制Cdk2等。这些研究所发现的肿瘤潜在治疗策略，应该得到特殊的关注。除此之外，其他癌基因相关的合成致死作用也开始被人们所关注。例如，有研究提示，KRAS 和Cdk4 的合成致死作用或可为非小细胞肺癌治疗提供新的可能。同时，研究者们也正在通过使用RNAi技术筛选基因组，寻找能与RAS协同起到合成致死作用的靶点。结语靶向治疗正在改变肿瘤患者的生存。全反式维甲酸使急性早幼粒细胞白血病成为可治愈的疾病。其他改变肿瘤患者生存的例子有伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病、他莫西芬和曲妥珠单抗治疗乳腺癌、PLX4032 治疗黑色素瘤、聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）抑制剂治疗乳腺癌、前列腺癌等。靶向治疗的进展在不断为肿瘤治疗提供新的可能。肿瘤治疗已经进入了个体化治疗的时代。我们获得肿瘤患者基因组和肿瘤基因表达信息、找到潜在治疗靶点、确定肿瘤的代谢特征适于特定的靶向药物治疗，我们将这些信息整合起来为患者定制个体化地治疗方案。2010年，自然（Nature）杂志对1500 名癌症研究科学家进行了调查，有75%的受调查者认为基于人类基因组信息的个体化治疗会在30年内成为肿瘤的常规治疗方法。1986 年，杜尔贝科（Dulbecco）在科学（Science）杂志上发表题为“癌