TTV核酸模板快速制备方法

1、TTV核酸模板快速制备方法              作者：苏明权 ，冯继红 ，于文彬，徐光华 ，马越云，张建芳 ，张林，刘家云 【关键词】  TT病毒关键词: TT病毒;聚合酶链反应;核酸制备 摘 要:目的  寻求建立适合大批量临床标本检测TT病毒（TTV）核酸快速制备方法，直接用于PCR扩增. 方法  应用蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法与直接快速裂解法，分别制备TTV核酸做PCR模板，用于TTV的聚合酶链反应的快速检测. 结果 

2、 在30例非甲非庚型肝炎血清和50例慢性乙型肝炎患者血清，应用经典的蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法和直接快速裂解法，分别制备TTV核酸模板，在相同条件下进行PCR扩增，结果两种制备方法的符合率为89%. 结论  TTV是一种新发现的肝炎病毒，目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据，建立了具有快速、简便、适合大批量临床标本中TTV核酸制备方法，对TTV肝炎的快速诊断，具有重要的意义.     Rapid preparation of transfusion transmitted virus nucleic acid template 

3、    SU Ming-Quan     1 ，FENG Ji-Hong     2 ，YU Wen-Bin     1 ，XU Guang-Hua     2 ，MA Yue-Yun     1 ，ZHANG Jian-Fang     1 ，ZHANG Lin     1 ，LIU J

4、ia-Yun     1    1 Center of Clinical Molecular Biology，Xijing Hospi-tal，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China，2 Deparment of Infectious Diseases，College of Medicine，Yan'an University，Yan'an716000     Keywords:transfusi

5、on transmitted virus;polymerase chain reaction;DNA preparation     Abstract:AIM To establish a method adapting to rapid preparation of TTV DNA from bulk samples for PCR.METHODS TTV nucleic acid template was prepared for PCR using two methods，viz.hydroxybenzene chloro-form extract

6、ion and directly rapid cracking.RESULTS DNA abstracted by the two methods was amplified at same PCR parameter and the coincidence rate was89%.CONCLUSION TTV is a new discovered hepatitis virus and the main laboratory diagnosis method is to detect it's DNA by PCR，so it is very important to establ

7、ish a method for rapid preparation of TTV DNA from bulk samples.     0 引言     TT病毒是近年新发现的一种肝炎病毒，当发现一种新的病原性相关病毒因子时，建立一种敏感、快速、特异的实验室检测方法并评价该病毒因子在肝病中的价值是十分重要的，该方法的临床适用性和可行性，是评价所建立方法在临床上应用价值的关键所在.目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据，建立具有快速、简便、适合大批量临床标本中TTV核酸制备方法，对TTV肝炎的快速诊断，具有重

8、要的意义.我们从临床快速检测需要为目的，寻求建立一种快速、简便的TTV核酸制备方法，用于大批量临床标本的检测，获得满意的结果.     1 材料和方法     1.1 材料  非甲非庚型肝炎血清30例，来自延安大学医学院传染科;慢性乙型肝炎患者血清50例，来自西京医院就诊患者;引物及合成:根据Nishizawa等1 报道的引物，外引物:RD037（正义链）5'-GCAGCAGCATATGGATATGT-3'RD038（反义链）5'-TGACTGTGCTAAAGCCTCTA-3

9、9;，扩增片段:270bp;内引物:RD051（正义链）5'-ATACA-CATGAATGCCAGGC-3'RD052（反义链）5'-GTACTTCTTGCTGGTGAAAT-3'扩增片段:196bp，由上海博亚生物技术有限公司合成.     1.2 方法 蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法:50L血清加200L裂解液（50mmolL-1 Tris-HCl pH8.0，200mmolL -1 NaCl，10mmolL-1 EDTA，20gL-1 SDS，1gL-1 蛋白酶K），60水浴60min，加等体积酚:氯仿:异戊醇（25241

10、）混匀，4冰浴下30min，2000g离心10min，取上清加等体积预冷无水乙醇-20过夜，1000g离心20min，沉淀溶于20L0.1×TE缓冲液中，备用.直接快速制备法:20L血清加50L快速裂解液（50mmolL-1 Tris HCl，pH8.0，50mmolL1 KCl，1.5mmolL-1 MgCl，10gL -1 NP-40，5gL-1 Tween-205gL-1 Triton X-100，2.0gL-1 SDS）煮沸20min，1000g离心10min，取上清做模板.PCR扩增:第1轮PCR扩增:总反应体积为25L，包括:10×PCR缓冲液2.5L;4×dNTP2.0L;外引物各1.0L（50pmolL -1 ）;DNA模板5.0L;Taq DNA酶3UL-1 ;无菌蒸馏水12.5L;无菌石蜡油30L覆盖液面，94变性3min，进入PCR循环，循环条件:9450s，5550s，7270s，32个循环，最后72延伸5min.第2轮PCR扩增:总反应体积为25L，包括:10×PCR缓冲液2.5L;4×dNTP2.0L;内引物各1.0L（50pmolL-1 ）;第1次PCR产物5.0L;Taq DNA