VEGF单克隆抗体对胰腺缺血再灌注损伤中细胞凋亡的影响

1、VEGF单克隆抗体对胰腺缺血再灌注损伤中细胞凋亡的影响         11-03-24 13:10:00     编辑：studa20                   作者：杨家红 谢嵘 王莹 范昕【摘要】  目的： 从胰腺腺泡细胞凋亡的角度探讨血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体

2、在胰腺缺血再灌注损伤中保护作用。方法： 采用钳闭大鼠腹腔干、肠系膜上动脉制备胰腺缺血再灌注损伤模型，并应用细胞凋亡原位标记法(TUNEL)、免疫组化技术等检测VEGF单克隆抗体干预后对胰腺细胞凋亡及Bax,Bcl2蛋白表达的影响。结果： 干预组15，30，60 min胰腺细胞凋亡指数显著低于缺血再灌注组(P<0.01)。正常胰腺组织未见凋亡调控基因Bcl2的表达, VEGF单克隆抗体干预后15，30，60 min胰腺细胞Bcl2染色阳性率明显高于缺血再灌注组(P<0.01)；正常胰腺组织见较弱的凋亡调控基因Bax的表达，而VEGF单克隆抗体干预后15，30，60 min胰腺细胞Ba

3、x染色阳性率明显低于缺血再灌注组(P<0.01)。结论： VEGF单克隆抗体能够通过抑制胰腺腺泡细胞的过度凋亡减轻胰腺炎的严重程度，该作用可能是通过促进抗凋亡Bcl2基因表达，抑制促进凋亡基因Bax表达来实现的。 【关键词】  胰腺； 缺血再灌注； 细胞凋亡； VEGF单克隆抗体； Bax； Bcl2    Abstract  Objective: To investigate the effect of VEGF McAb  protecting on pancreas injury during experimental i

4、schemic/reperfusion in rats.Methods： Ischemic/reperfusion models were made by ligated both the anterior menseneric artery and the celica artery of 70 rats.Apoptosis of pancreatic acinar cells was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTPbiot in nick end labeling(TUNEL) method,

5、and the expression of apoptosis regulated gene Bax and Bcl2 was detected by immunohistochemical technique. Results： The index of apoptosis increased significantly in pancreatic tissues after pancreatic ischemia/reperfusion injury but  offset by administration of VEGF McAb.Immunohistochemical an

6、alysis showed that just weak Bax staining cells were detected, with no Bcl2 positive staining cells in normal pancreatic tissues.The positive rate of Bcl2 protein in VEGF McAb group was significantly higher than ischemic/reperfusion group while the positive rate of Bax was significantly lower(all P&

7、lt;0.01). Conclusion： VEGF McAb treatment alleviated pancreatic ischemia/reperfusion injury by restraining excessive apoptosis.This effect might be related with upregulating the expression of Bcl2 and downregulating the expression of Bax.    Key words  pancrease;   isch

8、emic/reperfusion;   apoptosis;   VEGF McAb;   Bax;   Bcl2    缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤是一种常见的临床病理生理过程，在急性胰腺炎(AP)的发病机理中起着重要作用。近年的研究发现，I/R损伤与细胞凋亡有着密切的联系1，现已证实，AP大鼠的发病过程中胰腺存在细胞凋亡的改变，且与其病变的严重程度有关2。本实验旨在探讨血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体在I/R损伤后对胰腺细胞凋亡的影响及其

9、可能的机制，以探讨AP治疗的新途径。    1  材料与方法    1.1  动物及主要试剂    清洁级SD大鼠共70只，雌雄不限（江苏大学医学院实验动物中心提供），VEGF单克隆抗体（Santa Cruz 公司），鼠抗Bcl2单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）、兔抗Bax单克隆抗体（Santa Cruz公司），链霉素亲生物素过氧化物酶标(SP)免疫组化试剂盒(Biotech公司产品)。    1.2  方  法 

10、60;  1.2.1  动物分组  成年Wistar大鼠70只，随机分为对照组(10只)、缺血再灌注损伤组(30只)和VEGF单抗干预组(30只)，其中缺血再灌注损伤组和VEGF单抗干预组再分为15，30，60 min 3个时间点组，每组10只。    1.2.2  动物模型制作  术前12 h禁食不禁水， 0.5%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹正中切开，找到腹腔干和肠系膜上动脉。对照组不用血管铗钳闭腹腔干和肠系膜上动脉，直接取胰腺组织标本，心脏穿刺取血2 ml；缺血再灌注损伤组和VEGF单克隆抗体干预

11、组分别以血管夹阻断腹腔干和肠系膜上动脉15，30，60 min(各10只)后再灌注6 h，取胰腺组织标本。    1.2.3  干预及处理  VEGF单克隆抗体干预组于术前5 min 尾静脉注射VEGF单克隆抗体100  g/300 g，缺血再灌注损伤组仅注射等量生理盐水。    1.3  胰腺组织的检测    1.3.1  胰腺细胞凋亡的检测  按Boenger Manheim公司试剂盒说明操作，光镜下观察计算凋亡指数。凋亡指数(apoptosis index，AI)计算方法:数4个高倍视野，分别计算凋亡细胞数和总细胞数，AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%    1.3.2  免疫组化SP法检测胰腺组织细胞凋亡基因  胰腺组织常规石蜡切片， 二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，胰蛋白酶液消化，室温20 min。以下步骤按SP试剂盒说明操作， 光镜下计算胰腺细胞Bax,Bcl2染色阳性率。结果判断: 细胞染色呈棕褐色或棕黄色为阳性，Bax,Bcl2