盐酸小檗碱对糖尿病大鼠胸主动脉内皮损伤的保护作用.

1、盐酸小檗碱对糖尿病大鼠胸主动脉内皮损伤的保护 作用作者：张卓 王春梅王春艳 白岩王丽杰徐嘉琪陈立【摘要】目的探讨盐酸小檗碱对2型糖尿病血管内皮功能损伤的保护作用。方法采用小剂量链脲佐菌素腹腔注射加高脂饲料喂养的方法建立2型糖尿病大鼠模型。将模型动物随机分为模型组、盐酸小檗碱组，另设正常对照 组以及正常盐酸小檗碱组。用药组灌胃给药 8 w后，做葡萄糖耐量实验；检测 各组动物血清中空腹血糖（FPG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、空腹血清胰岛 素（FINS）的水平；检测血清中一氧化氮（NO）和超氧化物歧化酶（SOD含量；免疫 组织化学方法检测内皮型一氧化氮合酶（eNOS的表达。结果 与模型组

2、比较， 盐酸小檗碱治疗组FPG TC TG水平明显下降（PvO.05），血清胰岛素水平有所 升高，但无显著性差异（P> 0.05）;盐酸小檗碱能明显提高糖尿病大鼠胰岛素 敏感指数，同时提高大鼠对腹腔注射葡萄糖的耐受力，改善胰岛素抵抗（均PvO.01）;盐酸小檗碱可显著降低糖尿病组大鼠血清中NO含量，提高SOD水平（P<0.05，P<0.01）;显著降低胸主动脉组织eNOS蛋白表达（P<0.05）;而正常大 鼠给予盐酸小檗碱治疗，上述指标未出现明显改变。结论盐酸小檗碱对2型糖尿病大鼠血管内皮损伤具有明显的保护作用。【关键词】盐酸小檗碱；糖尿病；血管内皮；一氧化氮； eNO

3、S【Abstract 】 Objective To observe the effect of berberine on serum NO level, SOD activity and eNOS expressi ons of aorta in type 2 diabetic rats in duced by high fat diet plus STZ and explore the mecha nism un derly ing protective effect of berberi ne on en dothelial dysf unction. MethodsWistar rats

4、 were ran domly divided intodiabetic, control, diabetic rats treated with berberine (100 mg/kg), and con trol rats treated with berberi ne groups. After treatme nt, in traperit oneal glucose tolera nee test(IPGTT) was performed. The serum fast ing blood glucose, in suli n, total cholesterol and trig

5、lyceride levels were tested, and insulin sensitivity index was calculated. The serum NO level and SOD activity were measured. Inadditi on, eNOS protein expressi on was measured by immuno histochemical methods. ResultsBerberi ne sig nifica ntly decreased fasti ng bloodglucose, total cholesterol, trig

6、lyceride levels in diabetic rats.Berberi ne treatme nt also improved IPGTT in diabetic rats and enhan ced tissue sensitivity to insulin. After berberine treatment, serum NO level and SOD activity were in creased. Im mun ohistochemical results showed that berberi ne in creased eNOS expressi on in dia

7、betic rats aorta.C on clusi onsBerberi ne ameliorates diabetic en dothelialdysf unction through decreas ing blood glucose, lipid, impro ving in suli n resista nt, an tioxida nt effect and enhancing NO bioavailability.【Key words 】Berberi ne; Diabetes; Vascular en dothelium; NO;eNOS糖尿病并发心血管事件如动脉粥样硬化（A

8、S、冠心病发生率是同年龄组 非糖尿病患者的35倍，是糖尿病致死的主要原因之一1。内皮细胞功能 障碍不仅是AS形成的早期表现，也是糖尿病血管病变的始动因素和主要病理变 化。研究表明，高糖、高脂、胰岛素抵抗（IR）及氧化应激均可导致血管内皮受 损，发生功能障碍2；其治疗策略应该是调整糖脂代谢紊乱，同时改善血管 内皮功能损伤。但目前临床治疗糖尿病及其并发症的主要措施只是降低血糖或 直接针对并发症治疗。盐酸小檗碱（黄连素）是我国传统中药，近年临床及动 物试验均证明其具有确切的降血糖、降血脂、改善IR、抗过氧化等作用，对糖尿病具有显著的疗效35。但盐酸小檗碱是否可以减轻糖尿病引起的血管 内皮功能损伤，从

9、而防治糖尿病心血管并发症尚未见报道。本实验旨在探讨盐 酸小檗碱对2型糖尿病（T2DM）血管内皮功能损伤的保护作用。1 材料与方法1.1 动物及饲料选用健康清洁级雄性 Wistar大鼠，体重160180 g，由吉林大学实验动 物中心提供（许可证号：20030001）普通饲料成分及其热量：脂肪 5%碳水化合物53%蛋白质23%包括纤维素及水分在内的其他成分占19%总热量为25 kJ/kg ;高脂饲料成分及其热量：脂肪 22%碳水化合物48%蛋白质20% 包括纤维素及水分在内的其他成分占10%总热量为44.3 kJ/kg。1.2 药物及试剂盐酸小檗碱由东北制药厂赠予；链脲佐菌素（STZ为Sigma公

10、司产品； 葡萄糖、总胆固醇（TC、甘油三酯（TG检测试剂盒均为北京北化康泰临床 试剂有限公司产品；胰岛素放射免疫分析药盒购自天津九鼎生物技术有限公 司；一氧化氮（NO）和超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒购于南京建成生物技术有 限公司；内皮型一氧化氮合酶（eNOS）多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司；免 疫组化试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司；其他试剂均为国产分析 纯。1.3 仪器酶标仪Model 550，为BioRad公司产品。755B型紫外可见分光光度计，系上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂产品；台式高速低温离心机， 美国索福公司产品；1261型丫放射免疫计数仪，LKB公司

11、产品。1.4 T2DM动物模型的建立及分组460只Wistar雄性大鼠，随机分出正常对照组（CON和正常盐酸小檗碱组（CON+BER各10只，以普通饲料喂养；其余 40只用于建立T2DM大鼠模型，以高脂饲料喂养。大鼠高脂饲料喂养 4 w后，腹腔注射小剂量STZ（ 30mg/kg） 2次，间隔1 w； 2 w后检测空腹血糖（FPG）,以FPO 7.8 mmol/L作为 判断模型成功的标准。将制备成功的 T2DM大鼠26只随机分为糖尿病模型组（T2DM和盐酸小檗碱治疗组（T2DM+BER。T2DM+BE组和CON+BE组以盐酸 小檗碱100 mg - kg-1 d-1连续灌胃8 w，CONfi和T

12、2DMfi给予等体积溶媒灌 胃8 w。1.5 血清中FPG TG TC和空腹血清胰岛素（FINS）的检测大鼠治疗8 w后，禁食1216 h，乌拉坦（100 mg/kg ）腹腔注射麻醉， 腹主动脉取血并处死动物。每只大鼠约可以取血45 ml，分离血清，分装入Eppendof 管, -70C冻存，用于检测 FPG TG TC和 FINS。FPG TG和 TC采 用酶学方法检测。FINS由吉林大学第三医院核医学科采用放免法检测。1.6 葡萄糖耐量实验葡萄糖耐量实验进行前，大鼠禁食1216 h，自由饮水，腹腔注40%葡萄 糖（2 g/kg体重），在葡萄糖注射前、注射后 30、60、120 min断尾取

13、血，3 500 r/min离心15 min，吸取血清。随后按照试剂盒说明书，利用葡萄糖氧化 法测定血清中葡萄糖含量。1.7 血清中NO和SOD的检测分别按照NO和SOD式剂盒说明书方法测定血清中 NO及SOD勺含量。1.8 免疫组化方法检测大鼠胸主动脉组织 eNOS蛋白表达切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗。抗原热修复，已修复切片恢 复室温；PBS洗 3次，每次3 min ;滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 min。 滴加一抗(1 : 150)，4C过夜；PBS洗 3次，滴加生物素化二抗，室温 20 min ; PBS洗 3次，滴加链霉卵白素，室温20 min ; DAB显色。苏木精复染

14、2min、盐酸乙醇分化；脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照用PBS弋替一抗。于显微镜400倍下观察细胞质出现棕色或棕黄色颗粒者为阳性，不显色者为阴 性。1.9 统计学方法实验数据用x±s表示，统计分析采用SPSS 13.0软件处理，多组间比较 用单因素方差分析(One Way ANOVA方法，两组间比较采用最小显著差异(LSD)t 检验。2 结果2.1 盐酸小檗碱对大鼠体重和生化指标的影响T2DM&大鼠精神萎靡、毛发稀落欠光泽，糖尿病症状较重，与其他3组相比，体重略有升高，但无统计学差异(P>0.05)。T2DM+BE组大鼠经灌胃治疗8 w后，精神状态良好，毛发较润泽，

15、糖尿病症状明显减轻。与CONfi比较，T2DM& FPG TG和TC水平明显增高(P<0.05)，血清胰岛素水平略有降低，胰 岛素敏感指数(ISI)明显下降(PvO.05)。盐酸小檗碱治疗8 w显著降低了糖尿病 大鼠血清FPG TG和TC水平(P<0.05)，提高了 ISI(P<0.05)，而对正常大鼠血 糖及血脂没有影响。见表1。表1各组大鼠体重及生化指标变化(略)2.2 盐酸小檗碱对大鼠腹腔注射葡萄糖耐量的影响如图1所示，CONfi、CON+BE组及T2DM+BE组在葡萄糖注射后30 min血 糖达峰值，在90 min内逐渐下降；而T2DMS血糖在60 min达峰

16、值，后缓慢下 降，T2DM组血糖水平与CON&相比一直维持在较高水平。结果表明 T2DM大鼠 对葡萄糖耐受力下降，出现IR，而盐酸小檗碱可明显提高机体对葡萄糖的耐受 量，改善了 IR。2.3 盐酸小檗碱对血清NO含量和SOD舌性的影响与CONfi比较，T2DM组血清NC含量及SOD舌性明显降低（P V 0.01），盐酸 小檗碱治疗8 w后明显增加糖尿病大鼠血清 NC水平和SOD舌性（P V0.05），而 对正常大鼠NO水平及SOD舌性无明显影响。见表2。2.4 盐酸小檗碱对大鼠胸主动脉组织 eNOS蛋白表达的影响如图2B和图2C所示，CONfi® CON+BE组大鼠胸主动脉内

17、膜区（主要是 内皮细胞胞质）可见连续线状棕黄色阳性染色，即 eNOS阳性表达；而T2DM组 血管内膜区棕黄色着色明显减弱，局部出现未表达区（图2D）。盐酸小檗碱治疗组与T2DM组比较，eNOS表达明显增加（图2E）。表2 盐酸小檗碱对各组 大鼠血清NO SOD水平的影响（略）3 讨 论血管内皮损伤是糖尿病血管并发症的主要发病机制之一。高血糖、高血 脂、高胰岛素血症均会使氧化应激增加，氧自由基产生增多，造成血管内皮细 胞损伤2。因此，要想维持T2DM患者血管内皮的正常功能，同时改善患者 的糖、脂、胰岛素代谢是十分重要的。本实验显示，盐酸小檗碱可显著降低高 脂饮食联合小剂量STZ诱导的T2DM大鼠

18、FPG TG TC水平，并提高ISI，改善 IR，有效遏制了导致内皮细胞损伤的始动环节。NO是内皮来源的最重要的血管舒张因子，主要调节较大的输送血管张 力5。NO除了具有强烈的血管舒张功能外，还具有抗血小板聚集、抗平滑 肌细胞增殖和抑制单核巨噬细胞向血管迁移等作用。因此，NO生物活性下降可导致内皮依赖性血管舒张功能损害和促进动脉粥样硬化的形成。NO被认为是动脉粥样硬化的一个最重要保护因子，是机体对抗动脉粥样硬化的第一道防线6。糖尿病时NO减少可能是合成减少和灭活增加造成的。内皮细胞 NO的来 源主要通过存在于胞内的eNOS催化L精氨酸脱胍基而产生NO研究表明，糖 尿病时高血糖、IR状态、脂代谢

19、异常、炎性细胞因子分泌上调等多种因素均可 引起eNOS舌性下降或表达降低，从而使 NO合成和分泌减少，造成糖尿病内皮 依赖性血管舒张功能障碍而出现心血管并发症7。本实验结果表明盐酸小檗 碱有很好的保护血管内皮细胞的作用。氧化应激是糖尿病导致内皮损伤的主要原因之一。糖毒性，脂毒性等引 起的氧化应激使超氧阴离子等活性氧产生增多。超氧阴离子可迅速与NO发生反应，将其氧化生成过氧化亚硝基，而导致 NO灭活。过氧化亚硝基也可以将 eNOS勺辅酶BH4氧化为BH2降低BH4与BH2比例，从而使eNOS兑耦联，失去 催化生成NO的能力，反而催化超氧阴离子的产生，造成恶性循环8。SOD 是体内清除自由基的主要

20、酶系之一，可将超氧阴离子迅速氧化为O2和H2O2有效清除体内的氧自由基，减轻组织损伤。糖尿病高血糖可与SOD舌性中心的 赖氨酸结合，产生糖基化反应，使 SOD舌性下降，清除自由基能力下降9。 本实验结果显示，糖尿病大鼠血清 SOD舌性明显下降，盐酸小檗碱治疗显著提 高了血清SOD水平，增强其抗氧化能力，减少 NO的破坏，从而增加了 NO的生 物活性，保护内皮依赖性血管舒张功能。综上所述，盐酸小檗碱治疗显著改善了T2DM大鼠的糖、脂代谢和IR，提高了大鼠胸主动脉eNOS蛋白表达和血清SOD活性，增加了 NO合成，减少NO 破坏，保护糖尿病引起的内皮功能损伤。【参考文献】1 Vinik Al ，

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