淋巴细胞合成和释放儿茶酚胺的高效液相色谱检测 医学论文

1、    淋巴细胞合成和释放儿茶酚胺的高效液相色谱检测 医学论文              本文由中国论文范文收集整理。 【摘要】   目的：建立预处理淋巴细胞样品后经高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）检测淋巴细胞合成和释放儿茶酚胺（catecholamines，CAs）的 方法 ，并为淋巴细胞合成和释放CAs提供直接的证据。方法：淋巴细胞培养液上清经氧化铝吸

2、附，高氯酸洗脱；淋巴细胞经破细胞，去蛋白，高氯酸提取；采用AtlantisC18反相色谱柱分离淋巴细胞培养液上清以及细胞中的CAs，电化学检测器检测。结果：CAs分离效果良好，22 min内完成测定，各峰形对称，杂质峰少。用刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）诱导的淋巴细胞培养液上清中去甲肾上腺素含量最高，其次是多巴胺，肾上腺素最少；而Con A刺激的淋巴细胞内多巴胺的含量最高，其次为去甲肾上腺素，肾上腺素最少。结论：对淋巴细胞样品进行预处理能提高HPLC检测的灵敏度、减少干扰，这种方法可直接检测到淋巴细胞合成和释放CAs。 【关键词】   淋巴细胞；儿茶酚胺；高效

3、液相色谱法       Objective: To establish an improved method in order to effectively determine levels of catecholamines (CAs) including norepinephrine (NE), epinephrine (E) and dopamine (DA) in the cultured lymphocytes and in the supernatants of the cultures by high performance li

4、quid chromatography(HPLC). Methods: The CAs were extracted from lymphocytes by ultrasonication and from the extracellular medium by alumina absorption. Atlantis C18 column with electrochemical detection to was used simultaneously determine NE, E and DA in lymphocytes and the extracellular medium. Re

5、sults: CAs including DA, NE and E in the concanavalin A(Con A)-activated lymphocytes and their supernatants were able to be determined. Among the three kinds of CAS, DA had the highest content(1.922×10-19 mol/L·cell), E had the lowest content (0.612×10-19 mol/L·cell), and NE had

6、intermediate (1.452×10-19 mol/L·cell). In the supernatants, NE content was the highest (2.44×10-9 mol/L), DA medium(1.436×10-9 mol/L) and E the lowest (1.14×10-9 mol/L). Conclusion: The improved HPLC method can effectively detect CA levels including NE, E and DA in the cultu

7、red lymphocytes and the cultured supernatants, and it shows that lymphocytes have the ability to synthesize and secrete CAs.       Lymphocyte; Catecholamines; High performance liquid chromatography    机体内儿茶酚胺（catecholamines，CAs）包括去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、肾上腺素

8、（epinephrine，E）和多巴胺（dopamine，DA）。近年来 研究 发现，免疫细胞也能合成CAs，发挥免疫调节作用。但关于淋巴细胞合成和分泌CAs的直接证据 目前 仍未见报道。CAs的测定方法主要有三羟基吲哚法、乙二胺缩合法、放射酶学法、气相色谱法、色质联用法及稀土离子荧光探针法等，但存在成本高、步骤繁琐，灵敏度低等缺点。随着色谱技术的 发展 及日趋完善，高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）以其灵敏度高、重复性好的优点正逐渐取代其它检测方法，成为临床上检测生物样品中CAs含量最可靠的方法之一。然而，由于淋巴细胞合成

9、和释放的CAs极微量，本研究对淋巴细胞样品进行前期预处理，去除干扰因素，然后再采用HPLC经AtlantisC18反相色谱柱分离，电化学检测法检测，能很好地优化检测条件，取得了满意的分离检测效果。    1   材料与方法     1.1   淋巴细胞培养   SD大鼠（SPF级），体重200250 g，雌雄兼用，由南通大学实验动物中心提供。大鼠行颈椎脱臼法处死，无菌条件下取肠系膜淋巴结，以RPMI-1640基础培养液洗涤，碾碎，过滤，并以RPMI-1640基础培养液离心（2

10、00 g，5 min）洗涤3次。以完全培养液将细胞沉淀重悬，混匀。滴于计数板上计数，调整细胞浓度为（12）×106个细胞/ml，每ml细胞悬液中加入刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）5 l，置于37、5CO2、饱和湿度条件下培养48小时。    1.2   样品预处理   取培养48小时后的淋巴细胞悬液，离心（200 g，5 min），将细胞与培养液分离。取分离出的培养液上清，加入等体积的0.5 mol/L的Tris（pH=10）、50 mg氧化铝（预先在105中烘烤至少3小时）、适量的3,4-二羟基苄胺（dihydroxybenzylamine，DHBA）作为内标，轻摇15 min，离心去上清，用超纯水洗涤沉淀3遍，再加入0.5 ml 0.5 mol/L的高氯酸，充分振荡，离心200 g×8 min后取上清，用于HPLC测定。每毫升细胞沉淀中加入150 l的0.1N高氯酸，置于超声波细胞粉碎仪上对细胞进行破碎，后加入150 l的0.8 N高氯酸，离心（200 g，4，10 min）后取上清，其中加入适量的DHBA，用于HPLC测定。 关键词:检测,高效,释放,细胞,合成,淋巴,医学论文,淋巴细胞合成和释放儿茶酚胺的高效液相色谱检测 内容摘要:本文由中国