恶性B淋巴细胞性淋巴瘤克隆性重排检测研究

1、    恶性B淋巴细胞性淋巴瘤克隆性重排检测研究郑颂国陆孝禹张容轩罗建民肖力沈兆忠许良中 摘要：目的对恶性B淋巴细胞性淋巴瘤进行克隆性研究。方法用免疫组化法标记筛选恶性B淋巴细胞性淋巴瘤，用针对IgH单轮扩增引物进行多聚酶链反应扩增检测克隆性基因重排。结果在126例恶性B细胞性淋巴瘤中，免疫组化标记与IgH基因克隆性重排符合率为97%，其中，IgH基因克隆性重排阳性83例(66%)，3例见TCR交叉阳性，在1例病理诊断为颈淋巴结反应性增生病例中出现IgH克隆性重排，在其它22例非淋巴组织和良性淋巴组织疾患中均未见阳性。在18例临床诊断有争议的病例中11例

2、出现IgH克隆性重排。结论克隆性重排检测对恶性B淋巴细胞性淋巴瘤有一定的辅助诊断作用。 关键词：淋巴瘤，B细胞；基因重排；多聚酶链反应 STUDY ON DETECTING CLONALITY IN MALIGNANT B CELL LYMPHOMA ZHENG Song-Guo1，LU Xiao-Yu2，ZHANG Rong-Xuan3，et al. (1.Laboratory of Molecular Biology,Cancer Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai200032,China;2.Department of Pathol

3、ogy,Huadong Hospital,China;3.Department of Pathology,The First Lung Hospital of Shanghai,China) Abstract：ObjectiveTo investigate the clonality of malignant B cell lymphoma.MethodsSpecimens from 126 cases of malignant B cell lymphoma were studied by immunohistochemical methods(IHC) and were investiga

4、ted for gene rearrangements by PCR technique.ResultsIn 122 of 126(97%) cases,there was concordance between IHC and PCR.Family specific monoclonal IgH gene rearrangements were found in 83 out of 126 samples(66%) from malignant B cell lymphomas,only with 3 positive amplification of TCR gene rearrangem

5、ents.Monoclonality of B-lymphocytes wasnt detected in 22 cases of benign reactive diseases and non-lymphatic tumors.ConclusionsThe results provide an evidence to support the hypothesis of monoclonal origin of neoplasm and this technique may be useful in adjuvant diagnosis of malignant B cell lymphom

6、a. Key words：Lymphoma,B-cell；Gene rearrangement;PCR 恶性淋巴瘤分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkins lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins lymphoma,NHL)两大类。其中，HL因含有典型的R-S细胞而比较容易诊断，而NHL确是临床病理诊断和鉴别诊断中的难题，误诊率很高。在我国，NHL发病率占绝对优势(95%左右)，B细胞性和T细胞性淋巴瘤构成了NHL主要的免疫学亚型，国内又以B细胞性淋巴瘤为主(75%以上)。免疫组化技术的建立对区分NHL的免疫学亚型有很大的价值，其中应用免疫球蛋白轻链k，的单克隆(或多克隆)

7、抗体对部分B细胞性NHL有一定的帮助诊断价值，但在大多数情况下，免疫组化技术不能帮助判别良恶性。 B淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟，其免疫球蛋白重链(IgH)基因不断通过基因重排而形成功能基因，一旦某一克隆的B细胞发生恶性变化，此时即呈现特异的基因重排，运用Southern印迹和PCR技术可以检测这一重排基因，帮助判别克隆性性质。由于Southern印迹需要制备探针，经Southern印迹，分子杂交，放射自显影等步骤，手续繁杂，费时，并需用较大量的DNA及有放射性同位素的污染等缺点，制约了其在实际临床病理中的应用1。相反，PCR技术不仅具有Southern印迹相似的特异性，而且更加敏感，快

8、速并且无污染，国外已广泛应用。本研究在免疫学分型的基础上，对126例恶性B细胞性淋巴瘤进行IgH基因克隆性重排检测研究，并以反应性增生和非淋巴组织性肿瘤进行对照，在B淋巴细胞中检测TCR(T细胞受体，其克隆性重排是恶性T细胞的标志)基因作对照，以探讨检测IgH基因克隆性重排在恶性B细胞性淋巴瘤中的诊断价值。 材料与方法 一、组织学标本 1.新鲜标本和细胞学穿刺标本临床送检的新鲜淋巴结活检组织标本14例，细胞学穿刺标本18例(含2例骨髓穿刺标本)，立即置-70低温冰箱中保留待用。经临床病理和免疫组化标记证实为：B-NHL24例，淋巴结反应性增生6例，转移性癌2例。并用Raji细胞做B淋巴细胞恶性

9、克隆性阳性对照。 2.石蜡包埋组织标本经临床病理和免疫组织化学标记证实的B-NHL102例，T-NHL 18例，102例B-NHL中有疑难病例18例(临床诊断有不同意见)，所有标本均取自1990年以后上海肿瘤医院，华东医院，上海市第一肺科医院和全国各地疑难会诊标本。同时取淋巴结反应性增生10例，淋巴结转移性癌2例和非淋巴组织来源的肿瘤(如大肠癌等)3例。 二、免疫组织化学检测。具体方法见文献2。常规采用淋巴瘤筛选标记抗血清，分别为LCA(白细胞共同抗原)，免疫球蛋白轻链，轻链，L26(B细胞标志物)，UCHL-1(T细胞标志物)。 三、模板制备 新鲜组织和细胞学穿刺标本采用常规酚/氯仿提取法。

10、石蜡包埋组织切取6 m厚蜡片5片置入1.5 ml Eppendorf管中，二甲苯，乙醇常规脱蜡水化，加入蛋白酶K和SDS成分的消化液(终浓度分别为100 g/ml和1%)，56 1 h后，37水浴振荡中过夜，在用酚，氯仿常规萃取，上清液中加3 mol/L NaAc，使终浓度为0.3 mol/L，最后加入2.5倍体积的-20无水乙醇沉淀DNA，去盐后真空抽干，溶于适量TE中备用。 四、引物合成 IgH基因引物序列引自McCarthy提供的最常用IgH通用引物3，引物序列如下：上引物：5-CTGTCGACACGGCCGTGTATTTACTG-3；下引物：5-AACTGCAGAGGAGACGGTGA

11、CC-3。所期望的DNA扩增片断大小为100-150 bp。TCR基因引物序列亦引自McCarthy的报告4。选用D2J2引物序列，具体序列如下：D2：5-TCATGGTGTAACATTGTGGGGAC-3；J2：5-AGCACCGTGTGCCTGGTGCC-3。所期望的DNA扩增片断大小为55-90 bp。所有引物序列均由中国科学院生物化学研究所合成。 五、PCR扩增 应用美国PE公司生产的480型DNA扩增仪进行扩增。PCR反应体系为：DNA模板0.5 g，dNTP 0.6 mmol/L，Taq酶1.5 U，10x buffer 5l，引物分别为50 pmol，加水至40 l，加等量液体石

12、蜡油防止蒸发，设空白阴性对照。反应条件如下：94变性5 min，然后94 60 s，52 60s，72 90s，共36个循环，最后72延伸7 min。 六、PCR产物的电泳鉴定 制作8%非变性聚丙烯酰胺凝胶板，装入垂直电泳槽中，取10 l PCR产物+2 l含溴酚兰的加样缓冲液加入电泳槽孔中，同时加分子量Marker和阳性对照标本，电压120 V，1.5 h后取凝胶板常规固定，银染，玻璃纸封胶，凡在目标碱基对范围内出现明确扩增条带即可视为阳性。 结果 一、免疫组化标记结果 在126例B-NHL中，LCA阳性116例(92%)，L26阳性122例(97%)，UCHL-1阳性3例(2.4%)，其中

13、，4例LCA和L26均阴性。阳性24例(19%)， 20例(16)%。LCA，L26和UCHL-1的定位图(见插页第3页图3)。 图3B细胞淋巴瘤LCA(棕色)定位于细胞膜上(×100) 二、PCR检测IgH和TCR基因重排 在B-NHL中，无论是新鲜组织(包括活检和穿刺标本)还是石蜡包埋组织，经适当的模板制备技术及PCR扩增后，在目标基因范围内(IgH:100150bp；TCR：5590 bp)出现明显的DNA扩增条带，在反应性增生的淋巴组织中未见明显条带，仅在凝胶上见到染色均匀的弥漫阴影(smear)，非淋巴组织和T细胞淋巴瘤组织中亦未见条带(见附图)。 附图PCR检测IgH基因

14、重排 M：标志分子量，1：转移性癌，2：反应性增生，37：恶性淋巴瘤 其中47出现110 bp克隆性扩增条带 附表恶性B淋巴细胞增殖性疾患克隆性重排和免疫组化检测阳性病例数 类型 例数 IgH TCR LCA L26 UCHL-1 恶性B-NHL 126 83 3 116 122 3 24 20 新鲜组织 24 17 1 22 24 1 6 2 石蜡组织 102 66 2 94 98 2 18 18 结内组织 86 62 2 79 83 1 15 14 结外组织 40 21 1 37 39 2 9 6 反应性增生等 23 1 0 15 16 13 11 11 恶性T-NHL 18 0 6 16

15、 0 17 0 0 三、免疫组化标记与PCR扩增比较 恶性B细胞淋巴瘤克隆性重排和免疫组化检测结果详见附表。126例B-NHL中，IgH出现克隆性重排83例(83/126，66%)，LCA阳性标记116例(92%)，L26 122例(97%)，在83例IgH出现克隆性重排的病例中，LCA阳性78例(94%)，L26阳性79例(95%)，在4例LCA和L26均阴性的病例中，有2例出现IgH克隆性重排。 四、其它 在B-NHL中，24例新鲜组织标本中出现IgH克隆性重排17例(71%)，102例石蜡组织66例阳性(62%)，86例结内标本62例阳性(72%)，40例结外21例阳性(53%)，2例骨

16、髓穿刺标本，细胞学未见肿瘤证据，但经过PCR扩增，均出现IgH克隆性重排条带。 讨论 一、检测克隆性重排在恶性B细胞淋巴瘤辅助诊断中的价值 随着B淋巴细胞的不断分化成熟，其免疫球蛋白重链基因结构V，D，J，C区会不断发生重排组合5，若在某一特定的分化阶段发生肿瘤性增生，则其重排的基因是完全相同的，这为PCR技术检测B淋巴细胞肿瘤克隆性重排奠定了基础。国外在90年代初期开始应用，国内近2年少数大的科研单位开始应用。先期主要采用Southern印迹技术，但由于该技术费时较长，需要新鲜组织，并有同位素污染等缺点，限制了它在常规临床中的应用。PCR技术的建立，它可取代Southern印迹技术，进行淋巴

17、瘤克隆性重排的检测。PCR技术不仅与Southern印迹有相似的特异性，而且更加简单，价廉，快速，无同位素污染，敏感性更高，细胞学穿刺和石蜡包埋固定的组织标本同样适用1。 PCR技术已被广泛地，成功地用於各种遗传性疾病和基因病的诊断，McCarthy等在比较PCR与Southern印迹检测淋巴细胞的单克隆性性质时，发现PCR技术拥有Southern印迹技术相似的特异性3，Trainor等在研究55例B淋巴细胞增殖性疾患时，运用PCR技术检测出39例(75%)有特异性克隆性重排，与Southern印迹不相符的仅有3例，而此3例都是Southern印迹阴性，PCR技术阳性，提示PCR技术有高的敏感

18、性1。本研究采用IgH通用引物，在126例B细胞淋巴瘤中，发现83例(66%)出现特异性克隆性重排，出现克隆性重排的病人，大多数都是临床病理比较肯定的病例。比较有意义的是有18例病例，病理形态结合免疫组化仍不能作出明确的诊断，其中11例出现IgH克隆性重排，1例出现TCR克隆性重排。在对照组中，1例颈淋巴结反应性增生病例出现IgH克隆性重排，由于以往的文献报道PCR技术检测淋巴细胞克隆性没有假阳性，因此这例病例作者正在随访中。即使该例出现假阳性，也不能否定该技术在辅助诊断淋巴瘤中的重要价值。 二、检测克隆性重排对NHL免疫学分型和微小病灶早期复发病例的价值 Griesser等认为，免疫组织化学

19、技术对NHL和HL鉴别诊断价值不大，其原因是肿瘤细胞和反应性细胞都有自己的特异抗原表达，因此，不结合形态学，仅靠免疫组化技术不能区分良、恶性6。免疫组化技术在T，B细胞分型方面有独特价值，本实验发现126例B细胞淋巴瘤，92%的LCA，97%的L26有阳性表达，极少数不能表达LCA和L26的病例，可能由于B淋巴细胞所处的不同分化阶段有关，在4例LCA和L26均不表达的病例中，形态学诊断为B细胞性淋巴瘤，IgH在2例中出现克隆性重排，提示检测淋巴细胞克隆性重排也有助于淋巴细胞的免疫学分型。PCR技术已被广泛用于肿瘤的淋巴结微小转移和骨髓微灶侵犯79。在本实验中，比较有趣的是，有2例临床考虑淋巴瘤

20、侵犯骨髓，但反复细胞学穿刺并未见恶性证据，PCR检测确有IgH特异性克隆性重排，提示，该技术的应用可能有助于微小病灶，残留病灶和早期复发病人的诊断，Crotty等也有相似的报道10。 三、存在的问题和对策 用PCR检测淋巴细胞的克隆性重排也存在一些问题，主要是假阴性较高，石蜡包埋组织检出率低于新鲜组织，少数病例IgH和TCR出现交叉和双标记等等。由于国内基层单位绝大多数均无保留新鲜组织的条件，若不能在石蜡组织中开展此项工作，则会影响该技术在全国的推广和应用。在实验中，作者重点选择石蜡标本，并对石蜡组织的模板制备进行改进，作者的体会是只要石蜡包埋组织不超过5年，采用中性福尔马林固定，进行改良的模

21、板制备技术，因模板固定等原因引起的基因组断裂造成的假阴性可以克服。关于假阴性过高问题，作者也试图联合采用多对引物来提高其检测的阳性率，但实验结果显示，虽然提高一些阳性检测率，但提高的程度有限(另文报道)。因此，作者认为通过一定的技术优化，采用通用引物既比较适合于我国的国情，又可能帮助恶性淋巴瘤的诊断和鉴别诊断。 基金项目：本课题获上海市卫生局科研基金资助(96433) 作者简介：郑颂国，男，硕士，副研究员。 作者单位：郑颂国罗建民沈兆忠许良中上海医科大学肿瘤医院分子生物学实验室(上海 200032)； 陆孝禹肖力华东医院病理科； 张容轩上海市第一肺科医院病理科 参考文献 1Trainor KJ

22、,Brisco MJ,Wan JH, et al. Gene rearrangement in B-and T-lmphoproliferative disease detected by the polymerase chain reaction.Blood,1991,78:192 2郑颂国，刘尚廉，朱雄增，等.滋养细胞肿瘤PP11，PP19，PP25和PP26的免疫组织化学研究.肿瘤，1994，14：75 3McCarthy KP,Sloane JP,Wiedemann LM.Rapid method for distinguishing clonal from polyclonal B

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