散发性错配修复缺陷大肠癌的临床及分子生物学特征

1、散发性错配修复缺陷大肠癌的临床及分子生物学特征摘要目的：探讨散发性大肠癌中表现微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)大肠癌的临床病理和分子生物学特征。方法：79例未接受术前抗肿瘤治疗的大肠癌根治术组织收入研究，分析14个微卫星位点、K-ras基因和TGF-RII基因异常。结果：30/79例（38%）大肠癌显示不同程度MSI。11/79（14%）显示高度MSI(3 个位点)，其中9例（81%）显示TGF-RII基因（A）10处的框架移位，而只有1/10（10%）肿瘤带有K-ras基因突变，这组患者有较好预后的倾向；低度MSI肿瘤在2位点中显示MSI，其分子

2、生物学特征与非MSI肿瘤无差异。结论：肿瘤示高度MSI的患者，其临床病理及分子生物学特征与HNPCC相似，并有较好预后的倾向。应在诊治过程中注意鉴别这组患者，积极治疗。关键词结肠肿瘤；直肠肿瘤；微卫星不稳定性；错配修复中国书分类号R735.34文献标识码A文章编号1001-7399（2000）04-0290-04Clinical and molecular biological characters of sporadic mismatch repair deficient colorectal cancerSun Menghong(Dept of Pathol,Cancer Hospital

3、,Shanghai Medical University,Shanghai200032)Johannes Gebert， Magnus von Knebel Doeberitz(Division of Molecular Diagnosis and Therapy,Dept of Surg, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany)ABSTRACTPurposeTo analyze a patient subgroup with colorectal cancer(CRC) showing MSI (microsatellite instab

4、ility) and compare the clinicopathological parameters with the molecular phenotype of their tumors. MethodsSeventy-nine tumors derived from CRC patients without adjuvant treatment were included in the study. Alterations in 14 mostly intragenic microsatellite markers, mutations in the K-ras gene and

5、the TGF-RII gene were studied. Results30/79 (38%) CRC displayed different level MSI, with 11/79 (14%) showing high level MSI (MSI3 loci in the loci studied). Major high level MSI tumors (9/11, 81%) had a frameshift mutation at (A)10, while only 1 out 10 (10%) tumor possessed K-ras gene mutation. Pat

6、ients with low level MSI and no MSI has no difference in their molecular characters and clinical phenotypes. ConclusionThe subgroup of patients with high MSI has similar clinicopathological behavior like HNPCC associated cancers such as predominantly proximal tumor site, mucinous tumor type and a be

7、tter prognosis than remaining sporadic CRC.KEY WORDScolon neoplasms; microsatellite instability (MSI)； mismatch repair 大肠癌分为遗传性及散发性。遗传性大肠癌包括HNPCC (hereditary nonpolyposis colorectal cancer)和FAP (familial adenomatous polyposis)等，在西方国家占所有大肠癌的10%20%。其中大多数遗传性大肠癌是HNPCC。散发性大肠癌中约15%无家族史者表现与HNPCC相似的分子遗传学发病途

8、径14。作者对散发性大肠癌中表现微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)大肠癌的临床病理和分子生物学特征作一些探讨。1材料与方法11材料收集19861988年德国海德堡大学外科医院的79例接受大肠癌根治术患者肿瘤组织及其随访资料。术前均未经任何抗肿瘤治疗。不包括符合HNPCC标准者。12PCR及电泳微解剖分离癌组织(癌细胞含量80%)及正常粘膜并用常规酚/氯仿法提取基因组DNA。14对引物用于在PCR中扩增含微卫星重复序列的片段。PCR产物在ALF自动测序仪行聚丙烯凝胶电泳。电泳结果用片段分析软件（fragment manager, Pharmacia）

9、分析5。13MSI的判断参照Tibodeau6的标准：在正常组织的两个条带（峰）之外，至少有一个附加条带（峰）。在两个等位基因重叠时（not informative）, MSI的附加条带出现在主条带以外的区域。14K-ras及TGF-RII基因测序参见文献5。15统计学分析采用2分析。2结果21MSI的发生频率和型式30/79（38%）大肠癌显示不同程度MSI。其中11/79(14%)显示2个以上位点MSI。另19(24%)例肿瘤，9例在2个位点显示MSI，10例仅在1个位点上显示MSI。我们将3位点MSI的称为高度MSI，而2个位点的MSI称为低度MSI(表1)。在14个微卫星位点中，MSI

10、出现的频率不同。以高度MSI为例，NF1/2和D2S123位点示 100%的MSI，p53（5 bp重复序列）仅显示10% MSI。在低度MSI中，除DCC2(50%)外，均示较低MSI频率（表1）。MSI的型式也不同。在高度MSI中，一种MSI表现为在主峰周围或离开主峰的多个小峰，第二种MSI表现为一个或一个以上与主峰几乎一致的独立于主峰之外的峰型。在低度MSI中， MSI的峰型多表现为在主峰旁的一个附加峰。无论在何种MSI其型式都是由大小不一的插入和缺失引起，插入和缺失的范围在222 bp之间，均为微卫星重复单位或重复单位的整倍数。1示不同位点不同的MSI型式。2.2 LOH的发生频率LO

11、H在高度MSI肿瘤中少见。在仅有的5个LOH中，3个LOH分别出现hMLH1、 p53、 TAP1位点。另两个LOH出现在同一肿瘤的p53、 TAP1位点上，似乎集中在p53和TAP1基因。在低度MSI肿瘤中，LOH的频度很高，与非MSI肿瘤无区别。23TGF-RII基因和K-ras基因测序9/11（81%）肿瘤带有TGF-RII基因(A)10的框架移位，其中8例为一个A缺失，1例为两个A缺失。12例低度MSI和10例非MSI肿瘤均未显示TGF-RII(A)10突变。在10例高度MSI病例中，只有1/10（10%）显示K-ras基因编码子12的突变。16例非MSI肿瘤和7例低度MSI分别显示较

12、高ras基因突变率（6/16，35%；2/7，28%）。24MSI与临床病理的关系带有高度MSI表型的肿瘤多发于右半结肠（8/11，73%，P=0.002)；多为粘液腺癌（8/11，73%，P=0.003）。这组患者无家族史、无同时和异时肠内外肿瘤。19例低度MSI肿瘤与非MSI肿瘤以上指标未显示有统计学上的差异。11例肿瘤显示高度MSI的患者，与68例不显示MSI和低度MSI的患者比较，患者术后生存率有较高的倾向，但未显示统计学意义（P=0.07）。1不同MSI型式A、B示高度MSI，A中附加为主峰周围的小峰。B中为与主峰相似的附加峰。C、D示低度MSI。新增峰为主峰旁的一个附加峰。表1高度

13、和低度MSI肿瘤在各位点中的频率次别D5S107BRCA1ACTCD18S34DCC2D3S1611D2S123NF1/1NF1/2NF2/1NF2/2P53RBTAP1高度MSI10/119/1010/1110/117/115/1111/119/118/87/86/81/109/115/10(%)919091916445100901008875108150低度MSI4/200/204/205/2010/200/201/201/190/111/150/201/190/202/20(%)20020255005507050103讨论 将这些肿瘤按其受累及的微卫星位点多少区分为高度MSI(3个位点)

14、 和低度MSI（2位点）肿瘤。两组间存在以下的不同：（1）高度MSI肿瘤很少出现重要抑癌基因位点的LOH ，MSI出现在所检大部分位点上，TGF-RII基因框架移位突变常见，而ras基因极少突变。低度MSI肿瘤的分子生物学特征与非MSI肿瘤差异无显著性，表现为较高的LOH和ras基因突变率。（2）组织学类型：8/11例高度MSI肿瘤为粘液腺癌或印戒细胞癌（P=0.002）。（3）肿瘤的部位：8/11例高度MSI肿瘤位于右半结肠(P=0.003)。（4）肿瘤的预后：高度MSI肿瘤的预后与其他两组肿瘤相比有较好的倾向（P=0.07）。散发性大肠癌中这一组表现错配修复功能缺陷的高度MSI肿瘤，其分子

15、生物学特征、临床病理表现及预后都与HNPCC的发病惊人地相似，在其他作者的研究中也发现这一现象4,6，7。关于这部分患者的来源，看法不一。一种认为这些是未归类的HNPCC病人，因不符合HNPCC标准而无法诊断为HNPCC。但多数作者认为这是一组有别于HNPCC的亚群，因为他们无明显家族史，发病年龄较高，虽然表现明显的错配修复缺陷表型，但hMLH1和hMSH2基因很少出现生殖细胞突变，肿瘤组织中体细胞突变也不多见8。其发病可能通过其他不常见的错配修复基因突变或目前还未认识的与错配修复有关的基因受损。有研究证明错配修复基因的高甲基化可能是这部分患者错配修复缺陷及发病的原因9。在我们的研究中高度MS

16、I病例数（14%）与文献报道（15%左右）相似4, 6, 10。低度MSI肿瘤代表另一类大肠癌亚型。我们目前的分析无法将它们在临床病理上与一般散发性大肠癌区分开来。根据这种微卫星变化不出现在正常组织中这一事实，我们认为，单一附加峰有其特定的遗传学意义。其机制及对大肠肿瘤的影响还有待于进一步认识。MSI有不同的基本型式。这些不同峰型提示肿瘤细胞的错配修复缺陷有不同的方式。这些小的峰值可能还提示肿瘤组织中存在不同的克隆，他们的微卫星出现不同的变化，成为几种并存的峰型。TGF-RII是由肠上皮细胞合成的膜受体，可识别TGF并与之结合，抑制上皮细胞生长、促进细胞分化。TGF-RII在HNPCC患者和高

17、度MSI肿瘤中显示很高的突变率。突变集中在第三外显子的10个单碱基重复序列A中，在第七外显子的GTGTGT中也可出现GT 插入。我们的研究证明81%高度MSI肿瘤携带(A)10的突变。1个A和2个A缺失分别导致不同的蛋白截短（编码子161和129处）。TGF-RII 与TGF的结合点在肽链的-COOH端，截短蛋白的形成使这一结合位点消失而丧失识别功能，从而使这些细胞逃避TGF 的生长抑制和促进分化作用，进入无限制生长。TGF-RII作为一种结肠癌抑癌基因，在90%的以微卫星不稳定性为发病途径的肿瘤中突变。而这一突变发生于腺瘤重度非典型性增生腺癌的恶变过程中11。Grady发现，在15%表现高度

18、MSI的病例带有TGF-RII基因突变以外，另有15%非MSI大肠癌带有这一基因突变。除此之外，55%微卫星稳定大肠癌显示TGF-RII下游的TGF信号传导受阻11。这说明，TGF和TGF-RII传导通路受阻在散发性大肠癌发病中起重要作用。许宁建议，将RER (高度MSI) 作为亚临床分型的依据，并在临床用药中注意RER肿瘤对某些药物的耐药性12。无疑高度MSI肿瘤的临床病理、分子生物学特征和预后与一般散发性大肠癌不同，应该在诊断治疗中注意区分，积极治疗。基金项目：德国海德堡/曼海姆肿瘤中心（Tumorzentrum Heidelberg/Mannheim, IV-I-2）和德国癌症援助项目资

19、助（Deutsche Krebshilfe 70-1940-Ge I）作者简介：孙孟红，女，39岁，医学博士，助理研究员。研究方向：肿瘤分子病理学，主要研究大肠癌和淋巴瘤的分子病理学孙孟红（上海医科大学肿瘤医院病理科分子病理室200032）J Gebert（Division of Molecular Diagnosis and Therapy, Dept of Surgery, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany）M v Knebel Doeberitz（Division of Molecular Diagnosis and Therap

20、y, Dept of Surgery, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany）参考文献1， 徐宁，徐莉，邱红明. DNA复制错误与肿瘤. 临床与实验病理学杂志， 1999;15(3):5045052， 罗敏捷, 高玉彤, 来茂德. 检测微卫星不稳定性的银染色方法. 临床与实验病理学杂志， 1998;14(2):1931943， 孙孟红, 孙莉霞. 遗传性非息肉症性大肠癌及错配修复基因. 临床与实验病理学杂志， 1999;15(suppl):58604， Kim H, Jen J, Vogelstein B et al. Clinical a

21、nd pathological characteristics of sporadic colorectal carcinomas with DNA replication errors in microsatellite sequences. Am J Pathol, 1994；145:1481565， 孙孟红, Gebert J, M v Knebel Doeberitz. 散发性大肠癌肿瘤相关基因位点杂合性丢失分析. 中华实验外科杂志, 1999;16(6):5255266， Tibodeau SN, Bren G， Schaid D. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon. Science, 1993；260:8168197， Liu B, Nicolaides NC, Markotitz S et al. Mismatch repair gene defects in sporadic colorectal cancers with microsatellite instability. Nat Genet, 1995；9:48558， Senba S, Konishi