纳米及生物放大技术构建信号增强型电化学适体传感器的研究_图文

1、独创性声明学位论文题目：麴鲞垦垒堑塾盘垫垄蛰蕉焦量擅亟型垫垡堂垫堡堡盛墨鲍堑塞本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中己加了标注。学位论文作者：臼硫蜿签字日期：如年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保密期限至年月

2、止）。学位论文作者签名：自确螭导师签名：签字日期：动牛年要月日签字日期：力幺年，月占日目摘录要】第一章绪论电化学适体传感器适体概述电化学适体传感器的原理电化学适体传感器的分类信号放大技术在电化学适体传感器中的应用纳米材料放大技术在电化学适体传感器中的应用生物放大技术在电化学适体传感器中的应用多组分检测技术在电化学适体传感器中的研究进展本论文的研究思路第二章双酶功能化的空心铂钴纳米链为信号探针构建凝血酶电化学适体传感器引言实验部分仪器与试剂空心铂钴纳米链的合成。适体和双酶功能化空心铂钴纳米链的制备适体传感器的制备测试方法和检测原理。结果与讨论电极修饰过程的电化学表征。检测底液中葡萄糖浓度优化空心

3、铂钴纳米链和双酶对电化学信号的增强作用适体传感器的性能测试结论第三章葡萄糖氧化酶功能化复合物的直接电化学及电催化放大构建凝血酶适体传感器引言实验部分仪器与试剂纳米铂修饰的还原石墨烯纳米复合物的制备葡萄糖氧化酶和凝血酶适体修饰复合物的制备适体传感器的制备。测试方法和检测原理结果与讨论各种纳米材料的表征修饰电极的有效比表面积适体传感器组装过程的电化学表征实验条件优化，适体传感器的性能测试适体传感器的临床应用结论第四章酶的直接电化学和生物放大技术构建凝血酶适体传感器引言实验部分仪器与试剂。适体传感器的制备测试方法和检测原理结果与讨论电极制备过程的电化学表征。实验条件优化信号放大策略对传感器电化学响应

4、的贡献适体传感器的性能测试一适体传感器的临床应用结念第五章石墨烯复合纳米材料与生物放大技术构建信号增强型电化学适体传感器用于内毒素的超灵敏检测引言实验部分仪器与试剂纳米复合物的制备适体传感器的制各测试方法和检测原理结果与讨论各种纳米材料的表征电极组装过程的电化学表征实验条件优化不同修饰电极的电化学响应适体传感器的性能测试结论第六章碳纳米管和石墨烯双重放大的电化学适体传感器用于多组分的同时检测引言实验部分仪器与试剂。双酶和适体功能化的纳米铂氧化还原探针石墨烯纳米复合物的制备适体传感器的制备测试方法和检测原理结果与讨论各种纳米材料的表征电极修饰过程的交流阻抗表征。实验条件优化双酶和纳米铂的电催化放

5、大对传感器电化学响应的贡献碳纳米管和石墨烯对电化学信号的增强作用适体传感器的性能测试。结论参考文献攻读博士学位期间公开发表的论文和主持的课题致谢摘要纳米及生物放大技术构建信号增强型电化学适体传感器的研究分析化学专业博士研究生白丽娟指导教师袁若教授摘要电化学适体传感器通过测定适体与目标物作用前后电化学信号的变化来实现对目标分析物的定量检测，具有操作简单、响应快速、灵敏度高、选择性好等优点。将材料、生物及化学等多种放大技术结合，是实现高灵敏检测的有效方法。本文主要从功能化纳米复合物的制备，电极敏感界面的构建，新型信号放大手段的运用以及检测通量的提高等方面来构建电化学适体传感器，并对其原理及性能等进

6、行了探索和研究。研究工作分为以下几个部分：双酶功能化的空心铂钴纳米链为信号探针构建凝血酶电化学适体传感器采用模板法原位还原合成空心铂钴纳米链，用于修饰电活性物质二茂铁标记的凝血酶适体，再与葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物模拟酶结合，制得适体和双酶功能化的空心铂钴纳米链复合物。本研究基于该纳米复合材料作为信号探针成功制得了一种夹心型的凝血酶电化学适体传感器。利用该空心纳米链大的比表面积，可有效提高电活性物质和双酶的固载量，增强电化学响应信号。当检测底液中存在葡萄糖时，葡萄糖氧化酶首先催化葡萄糖产生，生成的再通过辣根过氧化物模拟酶和纳米铂的催化，从而进一步增强二茂铁的电化学响应信号，提高检测的灵敏度。实

7、验结果表明，利用空心铂钴纳米链作为固载基质可有效放大分析信号，提高适体传感器的灵敏度。葡萄糖氧化酶功能化复合物的直接电化学及电催化放大构建凝血酶适体传感器在玻碳电极表面修饰一层树枝状聚氨基胺碳纳米管复合物膜作为传感器的敏感界面，利用聚氨基胺表面大量的官能团以及碳纳米管空心管状结构具有大的比表面积，在增加修饰电极有效面积的同时提高凝血酶适体的捕获量。此外，本研究制备了纳米铂功能化的还原石墨烯复合物（），利用该复合物良好的生物相容性及大的活性表面在提高葡萄糖氧化酶（）和适体固载量的同时保持其良好的生物活性，并以此构建了夹心型凝血酶适体传感器。利用葡萄糖氧化酶的直接电子传递及催化作用，并结合纳米铂的

8、协调催化来实现检测信号的放大，提高检测的灵敏度。本实验对制备的复合纳米材料进行了表征，并对传感器的西南大学博士学位论文响应性能进行了研究。结果表明该方法切实可行，具有检测限低、选择性好等特点。酶的直接电化学和生物放大技术构建凝血酶适体传感器本研究利用辣根过氧化物酶的直接电化学，并结合两种新型生物放大技术，即目标物循环和杂交链式反应，实现了对于凝血酶的高灵敏检测。首先将巯基标记的捕获探针与凝血酶适体链互补形成双链并通过键固载到纳米金修饰的玻碳电极表面；当目标物凝血酶存在时，适体凝血酶复合物的形成使得双链被破坏，同时在外切酶作用下将与凝血酶结合的适体进行剪切，使得目标物凝血酶重新被释放和循环。随后

9、，将电极表面得到的单链捕获探针作为引发剂，与另外两条两端标记生物素的发夹型进行杂交链式反应，使得电极表面含有大量生物素标记的双链聚合物结构，从而可以引入大量亲和素标记的辣根过氧化物酶，利用辣根过氧化物酶的直接电子传递以及其自身的催化提高检测的电化学信号，进一步提高传感器的灵敏度。石墨烯复合纳米材料与生物放大技术构建信号增强型电化学适体传感器用于内毒素的超灵敏检测目前，利用内毒素适体作为分子识别元件构建适体传感器来检测内毒素的方法少有报告，且灵敏度并不理想。因此，本研究利用三条通过部分杂交形成的型连接体标记和剪切酶诱导的目标物循环放大，并结合纳米材料的信号放大构建了一种新型的信号增强型电化学适体

10、传感器用于内毒素的超灵敏检测。石墨烯与电活性物质甲苯胺蓝通过兀兀堆积作用形成的复合物能有效提高甲苯胺蓝的固载量，放大电化学信号，从而提高传感器的灵敏度。同时，型连接体标记的应用使得剪切酶的识别位点不局限于特点序列的目标，只要将其中两条（捕获探针和辅助探针）的碱基序列进行相应的改变，该方法对于其他目标生物分子的检测具有通用性。碳纳米管和石墨烯双重放大的电化学适体传感器用于多组分的同时检测为了提高适体传感器的检测通量，本研究以功能化的石墨烯纳米复合物作为信号标记，构建了一种新型的夹心型电化学适体传感器，实现了在同一敏感界面对于血小板源性生长因子和凝血酶的同时检测。采用还原石墨烯作为载体通过化学键合

11、作用修饰不同的电活性物质，随后在其表面原位还原产生纳米铂，用于固载对应的不同适体及葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，形成了多重标记的石墨烯纳米复合物。同时，采用纳米金包覆的单壁碳纳米管增加电极的有效表面积来增加适体的捕获量，进一步增加石墨烯纳米复合物的固载量。实验结果表明该复合物具有良好的电化学氧化还原活性，结合纳米铂与双酶良好的协同电催化活性，进一步放大电化学信号，从而实现了对于两种目标蛋白同时检测的高特异性和高灵敏度。关键词：电化学适体传感器纳米材料信号放大多组分同时检测：，：（），（）（），谢，（）。，西南大学博士学位论文（）（）也（），（）（），（）（），（），（）（，（），冲，（），：（

12、），（），【。兀，（）。（），（），）（西南大学博士学位论文（）（）（），：；第一章绪论第一章弟一早绪论殖比近年来的研究发现，和不仅对遗传信息具有存储和传递的作用，还可以藉其自身的空间结构与其它分子相互作用。人工设计合成的具有强识别及亲合力的单链寡核苷酸片段一适体（）的出现，使得抗原抗体之间的反应发生了新的革命性的变化。适体的出现，不仅弥补了现有抗体存在的不足，也为传统的免疫传感器的发展开辟了一条新道路。利用适体作为分子识别元件构建电化学适体传感器，受到了越来越多科学研究者的关注。本章主要概述了适体的体外筛选方法及其特点；阐述了电化学适体传感器的原理及分类；重点评述了各种信号放大技术和多组分检

13、测技术在电化学适体传感器中的应用及研究进展：在此基础上提出本文的研究思路。电化学适体传感器适体概述美国的和研究小组在年各自独立地建立了核酸文库，并发展了一种指数富集的配体系统进化技术（，简称作技术），用于从该核酸文库中筛选与配体具有高效和专一结合的或片段。该片段被称为适体（），也称为核酸适体、适配体、适配子等，是一段长度约个碱基的单链寡核苷酸，能与蛋白质、有机物、小分子、金属离子、多肽等各种配体特异性结合【巧】。目前，适体己被广泛应用于基础理论研究、药物的研发、疾病诊断和治疗等方面。适体的筛选一技术技术是从人工设计合成的大量随机寡核苷酸库中，经过多轮的重复筛选和富集而最终获得具有高亲合力和高特

14、异性的目标适体（图）。首先，利用化学合成法，人工构建一个碱基数为的随机单链寡核苷酸文库。通过组合化学的原理可知，该文库含有一个不同的随机寡核苷酸序列，说明该文库的库容大、多样性高。将寡核苷酸序列的两端人工设计为固定序列，便于在聚合酶链式反应（）扩增时与相关的引物结合。随机库在特定缓冲体系和温度下与靶分子目标物孵育，寡核苷酸可通过氢键、静电和形状匹配等与目标物结合，并通过物理方法将结合的序列初步分离出来。分离得到的结合序列通过扩增以及体外转录过程生成次一级的候选库，然后再与靶分子结合进入到新一轮的筛选，反复循环多次。在每次循环中，低亲合力的序列逐渐被淘汰，筛选出的核酸序列和靶分子的结合力都得到提

15、高。一般情况下，在经过大约轮的筛选富集后，可以西南大学博士学位论文得到高特异性和高亲合力的适体。为了使得筛选流程更为快速化和自动化，近年来又发展了多种新型的筛选技术，例如毛细管电泳交联筛选技术（），微流控芯片筛选技术（）和自动化筛选技术（）等，极大提高了筛选效率，开拓了适体的应用范围。、燃谍如删蝌耐船舞一。勺。（祭婚奄奄。拳的一心鬻幸矿仅以一。一一孑愁霉图适体的筛选过程示意图【。适体的优点将适体作为电化学适体传感器的分子识别元件，与其它分子识别元件相比具有以下的优点：（）体外筛选、化学合成：适体是通过技术体外筛选制备的，而不同于抗体的制备需要经过动物体内的免疫反应来获得，其制备过程更为简单和低

16、成本。筛选得到的适体可以通过化学的方法来生产合成，具有确定的组成和较高的纯度，有效地消除了制备过程的批间差异，便于大规模的生产制备。（）可修饰性：适体的本质是一段寡核苷酸片段，因此可以将其两端进行修饰，而对其生物活性并不产生影响。通常可以在适体的末端修饰生物素、氨基、巯基等用于固定，也可以采用电活性物质、发光物质或酶等对其进行标记。（）目标物作用范围广：通常情况下，抗体只能与特定的抗原特异识别，单链核苷酸只能与其互补的单链配对结合。适体不仅可以与抗体、酶、生成因子等大分子的蛋白质目标物结合，也可以与氨基酸、金属离子、药物、核苷酸等小分子目标物结合，甚至能与完整的细胞、细菌、病毒等目标物进行结合

17、【】。第一苹绪论（）高特异性和亲合力：适体和配体之间具有极高的亲合力，通常比抗体和抗原间的亲合力要强【】适体对配体的结合具有高特异性，即使靶分子上只存在一个集团的微小差异，适体也能将其分辨出来。适体甚至能识别出同一目标蛋白分子的不同构象，因而可以极大地避免非特异性结合所产生的影响。（）分子量小，结构简单：适体作为单链寡核苷酸片段，其碱基数一般为，分子量一般为。适体具有较小的分子量，便于修饰与固定：适体与目标物结合的空间位阻较小，有利于高密度传感整列的构建。（）稳定性好，可反复使用和长期保存：抗体作为一种蛋白质，容易变性，其活性容易受到温度和等外界条件的影响，保存时间较短。与抗体相比，适体具有良

18、好的稳定性，能在低温冷冻的条件下保存数年，即使在高盐浓度、高温和络合剂等的作用下发生变性后，也能在适当的条件下恢复其活性，因而可以反复利用，提高传感器的使用寿命。电化学适体传感器的原理电化学传感器是应用最广泛的一类传感器，具有成本低、响应快速、选择性好、灵敏度高、操作简单等优点。电化学适体传感器是将适体作为分子识别物质与电化学传感器相结合而构建的检测装置，其集合了电化学传感器和适体的优势，既具有电化学分析方法的高灵敏度、低检测成本、响应快速等显著优点，又具有适体的稳定性好、选择性高、特异性强等优点，在环境监测、药物分析、疾病诊断等方面具有十分广阔的应用前景。分识别信号转换麓待测物质丁嘛肝弋銎卦

19、善瓮譬觥圣待测物质之，湖一嗲一一渗可涮信譬要一其他物质薹炎矿化学焚化戆篓化学变化图电化学适体传感器的原理示意图。，电化学适体传感器可定义为一种将适体作为分子识别物质结合到感受器表面，通过换能器将目标分析物与适体作用产生的生物信号转换成为可检测的电化学信号的装置（图）。适体与目标分析物在感受器表面发生特异性识别反应后，产生相关联的生物信号，再通过换能器（测量电极、热敏电阻、场效应晶体管等）将该信号转换成与目标分析物浓度等相关的可定量处理的电化学信号，因而可以西南大学博士学位论文利用目标分析物与适体作用前后电化学信号的变化情况来实现对目标分析物的定量检测。目前，用于适体固载的工作电极主要有金电极、

20、氧化铟锡电极【、玻碳电极【】、金芯片电极【】和金阵列电极【】等。电化学定量检测的方法主要有循环伏安法【】、差分脉冲伏安法【】、溶出伏安法【、线性扫描伏安法【】、方波伏安法【】和法拉第阻抗谱【】等。电化学适体传感器的分类根据适体传感器的构建原理分类按照传感器的构建原理，可将电化学适体传感器分为三类：利用单链核酸适体直接与目标物作用构建的适体传感器；利用适体与互补链形成双链后，再与目标物作用构建的适体传感器；利用两条单链核酸适体分别与目标物作用构建的夹心型适体传感器。第一类电化学适体传感器是将单链的核酸适体固载到电极表面，将其直接与目标物进行结合，通过测定结合前后电极表面电化学信号的改变来直接对目

21、标分析物进行检测。等【】报道了一种快速检测检测溶菌酶的方法，如图所示，将溶菌酶适体直接修饰在金电极表面，适体与目标物溶菌酶结合之前，由于带负电的适体链对于溶液中六氨合钌阳离子（）的静电吸附作用，使得电极表面富集大量的（）而具有较大的电流响应值，当适体与中性条件下带正电的溶菌酶结合后，溶菌酶对于（）的静电排斥作用使得电流响应值减小，根据结合前后电流信号的减小值就可以完成对目标分析物溶菌酶的定量检测。这类传感器的优点是构建过程简单，便于实时监测，缺点是灵敏度较低。图单链核酸适体构建的电化学适体传感器原理示意图【】。第二类电化学适体传感器是将标记有电活性物质的适体及其互补链形成的双链结构固载到电极表

22、面，再利用其与目标分析物结合的结构变化引起的原有电化学信号的改变来实现对于目标分析物的定量检测。等【】将标记有电活第一章绪论性物质葸醌的凝血酶或的适体链与其互补链形成的双链结构修饰到电极表面，此时获得一个可检测的电化学响应信号，当目标物凝血酶或存在时，目标分析物与标记有电活性物质的适体链结合而使其从电极表面脱离，使得电化学信号降低，根据电化学信号的减少值可实现对目标分析物的定量检测（图）。一图适体及其互补链构建的电化学适体传感器原理示意图【】。译埝超兰丝上避三甄西南大学博士学位论文根据适体是否被标记分类按照适体是否需要标记，可以将电化学适体传感器分为免标记型和标记型两大类：免标记型的电化学适体

23、传感器不需要对适体进行标记，可以直接利用适体与目标分析物结合前后引起的电化学信号的改变来对目标物进行检测。这类传感器的电活性物质通常有三种存在方式：一是存在于检测底液中；二是通过静电作用直接吸附在核酸链上；三是直接将电化学物质修饰到电极表面。等【】在纳米金修饰的玻碳电极表面固定凝血酶适体，检测底液中的（）摊作为氧化还原探针，当大分子目标物凝血酶与电极表面的凝血酶适体结合后，电极表面的空间位阻增大，阻抗值增大，通过测定电阻值的变化来对凝血酶进行定量检测（图）。等【】设计了一种免标记的电化学适体传感器用于腺苷的检测，通过共价键合的方法将腺苷适体以及其互补链修饰到电极表面，腺苷适体与目标分析物结合后

24、，其互补链离开电极表面，使得电极表面的空间位阻减小而获得电化学信号的变化。这类传感器构建和操作简单，但由于电活性物质存在于溶液中，因而电极表面容易受到污染。，刚旷。图电活性物质存在溶液中的适体传感器原理示意图【。为克服这一缺点，后来的研究者们将电活性物质通过静电作用直接吸附到了核苷酸链上。等【】将巯基标记的与腺苷适体互补的单链固定到金电极表面，再与腺苷适体互补结合，通过静电作用将带正电的电活性物质亚甲基蓝吸附到带电的腺苷适体上，获得一个可检测的电化学信号，当目标物腺苷存在时，适体与腺苷结合而脱离电极表面，使得电极表面亚甲基蓝的量减少，电化学响应值减小，通过电化学信号的减少值实现对腺苷的定量检测

25、（图）。第一章绪论觚图电活性物质吸附在核苷酸链上的适体传感器原理示意图【】。为了获得更好的电化学信号响应，等【】通过静电吸附作用在金电极表面层层自组装含有大量电活性物质的纳米金硫堇的多层复合物膜，然后将凝血酶适体修饰在电极上，当与目标分析物凝血酶特异性结合后，由于大分子凝血酶蛋白对于电子传递的阻碍作用，使电极表面的位阻增大，电流值减小（图）。这类将电活性物质直接修饰在电极表面的电化学适体传感器无需标记、稳定性好、操作简单且对适体的活性不产生损伤，然而灵敏度相对较低。击彦。赢去麓攀彰击图电活性物质修饰在电极表面的适体传感器原理示意图【】。标记型的电化学适体传感器通常用电活性物质（如二茂铁【引、亚甲基蓝【】）、纳米粒子（如量子点【】、纳米金【】、纳米铂【等）或酶（如辣根过氧化物酶【】和碱性磷酸酯酶【）等对适体进行标