研究捷安肽素抗真菌作用机理

1、研究捷安肽素抗真菌作用机理    【摘要】  目的 研究捷安肽素的抗真菌作用机理。方法 采用形态学方法和同位素标记法。显微形态观察经捷安肽素处理后的供试真菌的形态学变化。进一步采用14C同位素标记的特异底物“尿苷二磷酸-（14C）-葡萄糖”示踪，研究捷安肽素对真菌(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性反应的影响。结果 显微形态观察表明，经捷安肽素处理后，供试真菌呈现球形膨胀，而且随着捷安肽素作用强度增强，球形膨胀的程度和发生频率也增加，提示捷安肽素的作用位点在真菌细胞壁。同位素标记实验表明，捷安肽素可抑制（1,

2、3）-D-葡聚糖合成酶的活性，降低真菌细胞壁合成过程中（1,3）-D-葡聚糖的放射性掺入，对疫霉菌和辣椒炭疽病菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶的抑制率分别达到77.7%和77.5%。结论 捷安肽素的抗真菌作用机理为：抑制细胞（1,3）-D-葡聚糖合成酶的活性，破坏真菌细胞壁的合成，造成真菌细胞壁组分（1,3）-D-葡聚糖的缺损和病原真菌生长抑制。  【关键词】  捷安肽素；抗真菌作用机理；（1,3）-D-葡聚糖合成酶     Abstract：Objective To inve

3、stigate the antifungal mechanism of Jiean-peptide.Methods The mode of action of Jiean-peptide against 4 phytopathogenic filamentous fungi associated with phytopathy:Phytophthora sp.,Colletotrichum

4、0;gossypii,Southw Botrytis cinerea and Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum was investigated by the method of morphology and isotope labelling.The (1,3)-D-glucan synthase assay was processed 

5、using isotope labelled substrateurdine diphosphate(14C)glucose to study the effect of Jiean-peptide on fungal(1,3)-D-glucan synthase.Results Micrographic observation revealed that the Jiean-peptide ma

6、de the hyphal expanded and globular.The(1,3)-D-glucan synthase assay showed Jiean-peptide could inhibit the activity of(1,3)-D-glucan synthase and reduce the radioactivity incorporation of(1,3)-D

7、-glucan.The inhibition percentages of Jiean-peptide against Phytophthora sp.and Colletotrichum gossypii Southw were 77.7% and 77.5% respectively.Conclusion The antifungal mechanism of Jiean-peptide

8、60;was the inhibition of enzyme activity of(1,3)-D-glucan synthase.     Key words:Jiean-peptide；antifungal mechanism；(1,3)-D-glucan synthase       捷安肽素是一种由芽孢杆菌产生的抗真菌活性多肽，具有广谱抗真菌活性，而且稳定性好、抑菌持

9、久，具有很好的开发前景1，2。从捷安肽素对疫霉菌、辣椒炭疽病菌、灰霉菌、棉花枯萎病菌等多种常见重要植物病原真菌的抑菌性能可知，捷安肽素可以通过抑制真菌孢子萌发、菌丝生长而发挥抗真菌生长作用。形态观察发现，捷安肽素可以破坏真菌的细胞壁结构，使真菌细胞呈现原生质球状3。（1,3）-D-葡聚糖合成酶（EC2.4.1.34；尿苷二磷酸-葡萄糖/(1,3)-D-葡聚糖-3-葡糖基转移酶）是一细胞膜结合酶，在细胞膜内侧聚合UDPG形成葡聚糖纤维，葡聚糖纤维分泌出细胞膜形成网状支架，对真菌细胞壁的完整性及保护真菌抵抗低渗透压起重要作用4，5。本文作者采用形态学方法和同位素标记法研究捷安肽素对真菌细胞壁及其（

10、1,3）-D-葡聚糖合成酶的作用，进一步深入探讨捷安肽素的抗真菌作用机理，为捷安肽素的进一步开发提供理论基础。     1  材料     1.1  菌种     疫霉菌（Phytophthora sp.）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum gossypii Southw）、灰霉菌（Botrytis cinerea）、棉花枯萎病菌（Fusarium 

11、;oxysporum f.sp.vasinfectum），均为本实验室保藏菌种。     1.2  培养基     马铃薯葡萄糖液体培养基。     1.3  主要试剂     捷安肽素原液（生物效价为19.5 mm）由本实验室提供；尿苷二磷酸-（14C）-葡萄糖UDP-（14C）-G，Perkin-Elmer进口产品；2,5-二苯基&#

12、160; 唑（2,5-Di-phenyloxazole,PPO），Fisher进口产品。（捷安肽素的生物效价采用管碟法2测定，以疫霉菌为检验菌株，以抑菌圈直径为效价指标）。     1.4  主要溶液     粗酶提取缓冲液5×10-2mol/L Tris-HCl pH7.5,1mol/L葡萄糖，1×10-3mol/L EDTA，5×10-3mol/L MgCl2,1×10-2mol/L

13、 NaF,层析展开剂95%乙醇,1mol冰醋酸（73，V/V）,闪烁液1g PPO，200 ml甲苯。     1.5  主要仪器     SHZ-82大容量回旋振荡器  德国ZAISS,AXIOPLAN2型多功能显微镜,PHS-3精密数显酸度计Sigma 3K30高速冷冻离心机,FJ-353G1型双道液体闪烁计数器等。     2  方法

14、0;2.1  捷安肽素作用下供试菌的形态观察     将疫霉菌、辣椒炭疽病菌、灰霉菌、棉花枯萎病菌接种于马铃薯液体培养基(终孢子浓度为106个/ml)，25150 r/min振荡培养48 h。每隔2 h取样，用0.05%的乳酚蓝染色液对样品进行固定、染色、显微观察孢子萌发情况和菌丝生长情况。设置3个实验组，捷安肽素的处理浓度分别为原液浓度、1/2原液浓度和空白对照。     2.2  捷安肽素样品的处理  

15、   将捷安肽素样品分为两组，组不做任何处理,生物效价为19.5 mm；组用30%的NaOH调pH为10，再以15%的HCl调pH为7.5，生物效价为零。     2.3  制备（1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液     分别接种疫霉菌和辣椒炭疽病菌于马铃薯葡萄糖液体培养基中，疫霉菌30、150 r/min振荡培养30 h；辣椒炭疽病菌25、150 r/min振荡培养36h,收集培养液，离心洗涤获得菌丝体。

16、(1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液的制备采用文献6的方法，经适当改进。液氮研磨菌丝体后加入粗酶提取缓冲液，充分振荡混匀于4、3 500g离心10 min。收集上清夜，再将上清液于4、50 000g离心45 min。所得沉淀为粗酶制品,悬浮于503×103mol/L Tris-Hcl pH 7.5（含33%的甘油）中，用Bradford法测定酶蛋白含量，蛋白浓度控制在35 g/l,于-70保存备用。     2.4  （1,3）-D-葡聚

17、糖合成酶粗酶的活性测定    采用14C标记的特异底物UDPG，与(1,3)-D-葡聚糖合成酶进行酶反应，闪烁计数检测反应产物(1,3)-D-葡聚糖的放射性，确定(1,3)-D-葡聚糖合成酶粗酶液的活性。     2.4.1  (1,3)-D-葡聚糖合成酶反应7     反应体系40l，包括253×103mol/L Tris-HCl pH7.5,0.5 mol/L葡萄糖，103×103m

18、ol/L NaF,5 mg/ml BSA,740 Bq UDP-（14C）-G和10 l(1,3)-D-葡聚糖合成酶粗酶液。以加入10 l双蒸水的反应组作为(1,3)-D-葡聚糖合成酶粗酶液的空白对照组，以加入10 l沸水浴30 min灭活的粗酶液的反应组作为(1,3)-D-葡聚糖合成酶粗酶液的阴性对照组。每组反应重复2次。反应系统于30保温30 min，最后加入4 l冰乙酸终止反应。     2.4.2  (1,3

19、)-D-葡聚糖合成酶反应产物的分离和放射性测定    反应终止后，按文献8的方法进行反应产物的分离。将反应液点样于新华3号滤纸上，下行层析过夜。取出滤纸风干，剪下原点，于FJ-353G1型双道液体闪烁计数器测定每分钟闪烁次数（Cpm），表示同位素标记的(1,3)-D-葡聚糖的放射性强度，并以此衡量(1,3)-D-葡聚糖合成酶的活性。FJ-353G1型双道液体闪烁计数器对C14探测效率大于70%；闪烁液放射本底小于60 次/min。     2.5  捷安肽素对（1,3）-D-

20、葡聚糖合成酶反应的影响    按2.3方法进行捷安肽素影响下的(1,3)-D-葡聚 糖合成酶反应和产物分离与放射性检测。反应设置3组：捷安肽素处理组、捷安肽素处理组和捷安肽素空白对照组。实验中捷安肽素或双蒸水加样量均为2l，每组重复10次。根据反应产物的放射性计算产物的放射性掺入率和捷安肽素对酶反应的抑制率。掺入率=处理组产物放射性/对照组产物放射性×100%，抑制率=1-掺入率。2.6  数据处理     采用统计分析软件SPSS11.5进行数据的单因素方差分析。

21、     3  结果与分析     3.1  捷安肽素对各病原菌形态的影响     光学显微镜观察捷安肽素作用下各病原真菌的菌丝和孢子形态（0.05%的乳酚蓝染色液染色），可见供试真菌的孢子和菌丝形态有显著的变化，孢子和菌丝体膨大、畸形、原生质凝聚、孢子不萌发或萌发异常、菌丝上产生大量球形膨胀泡囊、生长受阻。随着捷安肽素处理的时间增长或浓度加大这种球形膨胀的程度和发生频率也增大。图1所示为培养24h的供试病

22、原真菌,捷安肽素处理浓度为1/2原液浓度，其中对照菌丝表面光滑、结构完整，处理菌丝均呈现不同程度的球形膨胀。众所周知，真菌的细胞壁是细胞规范和维持形态所必需的,一旦细胞壁受损，细胞的原生质体在胞内渗透压的作用下，便会形成球状。由此推测捷安肽素破坏了供试真菌的细胞壁，从而使之呈现球形膨胀。     3.2  （1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液的制备和活性    采用2.3方法制备出疫霉菌和辣椒炭疽病菌菌丝的（1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液，经检验该（1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液的阴

23、性对照组与空白对照组结果相同，反应产物的放射性均小于60 Cpm，为闪烁液本底值，没有酶活；实验组反应产物的放射性为3 0005 000 Cpm，表明（1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶具有催化活性，可用于进一步的实验。     3.3  捷安肽素对（1,3）-D-葡聚糖合成酶反应的影响    按照方法2.5，采用14C同位素标记的特异底物“UDP-（14C）-G”示踪，用捷安肽素      

24、;     处理（1,3）-D-葡聚糖合成酶反应，测定反应产物（1,3）-D-葡聚糖的放射性。结果表明疫霉菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶反应中，处理组、的放射性掺入（%空白对照）分别为22.3%±2.8%和96.0%±0.8%；辣椒炭疽病菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶反应中，处理组、的放射性掺入（%空白对照）分别为22.5%±2.5%和74.7%±3.0%，见图2。     图2  捷安肽素对（1,3）-D-葡聚糖放射性掺入的影响

25、60;    Fig.2  The effects of Jiean-peptide on(1,3)-D-glucans radioactive incorporation     如图2所示，在疫霉菌和辣椒炭疽病菌的（1,3）-D-葡聚糖合成酶反应中，捷安肽素处理组、的放射性掺入均低于空白对照组，但其各自的组间差异不同。进一步采用统计分析软件SPSS11.5对数据进行单因素方差分析，比较组间差异是否显著，结果见表1和表2。表

26、1  捷安肽素对疫霉菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶的影响从表1可知，疫霉菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶反应中，捷安肽素处理组和处理组之间、捷安肽素处理组和空白对照组之间均差异显著（P10.01,P20.01,n=10），处理组和空白对照组之间差异不显著（P30.05,n=10），表明捷安肽素处理组可抑制反应产物的放射性掺入，抑制率为77.7%±2.8%；捷安肽素处理组不能抑制反应产物的放射性掺入，抑制率4%±0.8%属于实验误差，不具有统计意义。表2  捷安肽素对辣椒炭疽病菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶的影响从表2可知，辣椒炭疽病菌（

27、1,3）-D-葡聚糖合成酶反应中，捷安肽素处理组、处理组、空白对照组相互之间均差异显著（P10.01，P20.01, P30.01,n=10），表明捷安肽素处理组和捷安肽素处理组均可抑制反应产物的放射性掺入，抑制率分别为77.5%±2.5%和25.3%±3.0%。     在本实验中，捷安肽素处理组(效价为19.5mm)对辣椒炭疽病菌和疫霉菌的（1,3）-D-葡聚糖合成酶均具有抑制作用，这与它拥有生物活性的特性相一致。而捷安肽素处理组的效价为零，即没有生物活性，但它对辣椒炭疽病菌的（1,3）-D-葡聚糖合成酶却表现

28、出了抑制作用。分析原因可能是因为捷安肽素的生物效价测试菌为疫霉菌，捷安肽素无生物活性只是相对疫霉菌而言。而辣椒炭疽病菌对捷安肽素的敏感性不如疫霉菌对捷安肽素的敏感性高3，所以对于同一浓度捷安肽素处理，辣椒炭疽病菌的酶反应受抑，疫霉菌的酶反应不受抑制。     4  讨论     随着现代科学技术的迅速发展，放射性核素正广泛地应用于生物学、医学和农学等学科的各个领域，大大地推动这些学科进入分子水平的新阶段。酶的放射性分析方法9即是采用放射性标记底物与酶液在适宜的条件下保温一段时

29、间后，分离、测定酶催化底物所生成的产物的放射性而确定酶活性，是生物研究中最常用的方法。其它细胞壁相关酶类的分析法包括生物化学法、原位分析法、荧光染色等，但都不如放射性分析方法灵敏、快速、简便。因此，本实验采用酶的放射性分析方法研究捷安肽素的抗真菌作用机理：从疫霉菌和辣椒炭疽病菌中提取细胞壁合成中重要的（1,3）-D-葡聚糖合成酶，采用14C放射性标记的特异底物“尿苷二磷酸-（14C）-葡萄糖”示踪，研究捷安肽素对(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性的影响。     已知抗真菌多肽的作用机理主要有两种10：一种是干扰真菌的细胞壁组分葡聚糖、几丁质和各

30、种甘露蛋白的合成，导致细胞壁的缺损。如棘白霉素类化合物能结合-1,3-D-葡聚糖合成酶复合体的Fksp亚基而干扰-1,3-D-葡聚糖的合成，发挥抗真菌作用11。另一种是在细胞膜上形成电势依赖的或其它的通道，改变细胞膜的通透性，使细胞内容物泄露。陈刚、裴炎等通过检测抗真菌多肽APS对脂质平面膜电学性质的影响发现APS可在细胞膜上持续形成孔道（pores），破坏膜的完整性，引起细胞内容物的外流，最终导致真菌的死亡12。本实验研究发现，捷安肽素可使疫霉菌和辣椒炭疽病菌的-1,3-D-葡聚糖合成酶的反应产物的放射性掺入率降低。由此推测捷安肽素可能的抗真菌机理是：抑制真菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶活性

31、，造成真菌细胞壁组分（1,3）-D-葡聚糖的缺损，破坏真菌细胞壁的完整性，造成病原真菌生长抑制。真菌的细胞壁合成是一个非常复杂的过程，涉及许多酶类13，捷安肽素对真菌细胞壁合成相关的其它酶类如几丁质合成酶等的酶活性有无作用还有待进一步研究。     植物真菌病害是目前较难防治的农作物病害，一直制约着农业经济的发展。而过度地大量使用化学农药，已造成了全球生态环境的不断恶化及粮食危机，发展无公害生物农药已是大势所趋。捷安肽素抗真菌作用机理的初步阐明，有助于捷安肽素作用机理的更深层次的研究，有助于建立农用抗菌素的筛选模型、利用分子设计手段进行分子的改

32、造和新的抗菌物质的合成，同时为捷安肽素开发为新型生物农药提供生产、制剂、使用等方面的理论依据。同时，因为动物细胞没有细胞壁，捷安肽素对真菌细胞壁合成的抑制作用，为捷安肽素向人药发展提供了可能。 【参考文献】   1ZHONG Juan,ZHOU Jinyan,TANG Hong.Mutation Breeding of a Strain Producing High-yield Jiean-peptide,an Antifungal P

33、eptideJ.Chin J Appl Environ Biol,2004,10(1):104-107. 2LAI Yana,TAN Hong.Fermentation Conditions for Antifungal Polypeptide Jiean-peptideJ.Chin J Appl Environ Biol,2004,10(2):231-235. 3DAI Fuying,ZHONG Juan

34、,ZHOU Jinyan,et al.Inhibition Property of a Novel Antifungal Polypeptide Jiean-peptideJ.Chinese Journal of Antibiotics, 2005,9:516-520. 4CM Douglas.Fungal -(1,3)-D-glucan SynthesisJ.Med.Myco l,2001,39:55-66.

35、60;5Hans de Nobel,Herman van den Ende,Frans M.Klis.Cell Wall Maintenance in FungiJ.Trends in Microbiology,2000,8(8):344-345. 6Luis Antelo,Eric G.Cosio,Norbert Hertkorn,et al.Partial Purification of a GTP-insensitive(13)-glucan Synthase from Phytophthora SojaeJ.FEBS Letters,1998,433:191-195. 7CM Douglas,JA Marrinan,W Li,et al.A Saccharomyces Cerevisiae Mutant with Echinocandin-resistant 1,3-b