细菌的黏附及侵袭

1、细菌的粘附与侵袭细菌的粘附与侵袭 粘附的定义 粘附是细菌的粘附素(配体)与宿主细胞相应受体之间的特异性结合过程，宿主细胞是否具有相应的受体及受体的类型，决定着细菌能否在特定的部位粘附定植。物理化学力特异性粘附粘附机制细菌粘附研究实验方法粘附细菌粘附的一般过程 粘附的第一步是非特异性的,借趋化作用使细菌和易感宿主细胞表面接近及定位,继之细菌菌毛末端的配体(Ligand)与易感宿主细胞表面处于静电荷及疏水性结合; 第二步是特异性的,即在第一步的基础上,使各菌毛的特殊配体进一步与相应特异性受体结合,如大多数大肠杆菌的F1只能和上皮细胞的D甘露糖受体相结合。非特异性粘附 细菌的非特异性粘附主要由细菌与

2、靶细胞表面的分子疏水性、分子间力(范德华氏力)和静电引力的大小起主要作用，不依赖于粘附素的存在，其中分子的疏水性尤为重要。细菌表面疏水性的强弱，是由疏水物质的含量决定的。非特异性粘附的特点 细菌或细菌某一成分既能吸附于疏水物质(如疏水胶、碳氢化合物等)，又能粘附于上皮细胞，这种粘附可被外源性非特异性疏水物质或亲水物质所阻断。特异性粘附 细菌的特异性粘附是借特异性识别分子(粘附素，配体)和靶细胞表面的相应受体相结合，在空间构型上两个分子相匹配。特异性的分类 宿主特异性:由于不同种系动物在遗传学上的差异，细胞膜表面成分不尽相同。只有宿主组织内有相应的受体，细菌才能在宿主体内定居、繁殖。这由同一细菌

3、表面的抗原性决定。l组织特异性:一种细菌只能在特定的组织或器官内定居。 病原菌病原菌 组织组织淋病奈瑟菌 尿道上皮细胞脑膜炎奈瑟菌 鼻炎上皮细胞霍乱弧菌 肠道上皮细胞百日咳博带式杆菌 呼吸道上皮细鼠伤寒沙门氏菌 肠道上皮细胞幽门螺旋杆菌 胃粘膜酿脓链球菌 咽上皮细胞空肠弯曲菌 肠道上皮细胞肺炎支原体 呼吸道上皮细胞 细胞的特异性：定居于一定部位的细菌，能选择性地粘附某一类型的上皮细胞。 例如:同是在呼吸道定居的致病菌，脑膜炎球菌特异地粘附非纤毛上皮细胞，多杀巴氏杆菌(pasteurelIa multieida)能特异地粘附鳞状上皮细胞，百日咳杆菌则粘附于支气管纤毛上皮细胞。 同一型细胞表面成分

4、改变后，能被不同的细菌粘附:颊粘膜细胞表面包被血浆纤维粘连蛋白(Fibronectin，Fn)时，有革兰氏阳性菌粘附，无Fn时，粘附革兰氏阴性菌，Fn存在一定量时，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均可粘附。特异性粘附需要的物质基础 细菌表面的粘附结构粘附素 宿主细胞表面的特异性受体配体（粘附素）和受体 细菌表面的特异识别分子配体(ligand)和宿主上皮细胞表面对应的识别分子受体(receptor)是细菌实现粘附的物质基础，二者互相紧密粘附结合，有利于细菌定居、繁殖、内化（侵袭）和致病。配体粘附素 使细菌粘附在敏感细胞的表面，利于细菌的定植、繁殖,与细菌的致病性密切相关，称为粘附素。根据来源分为菌毛

5、粘附素和非菌毛粘附素。 菌毛粘附素：由细菌菌毛分泌并存在于菌毛顶端； 非菌毛粘附素：来自于细菌表面的其他组分，如G-菌外膜蛋白和G+菌细胞壁。如鼠疫杆菌的外膜蛋白、A群链球菌细胞壁的脂磷壁酸等。菌毛粘附素 普通菌毛是细菌的粘附结构，能与宿主细胞表面的特异性受体结合，菌毛的受体常为糖蛋白或糖脂，与菌毛结合的特异性决定了宿主感染的易感部位。有菌毛的粘附可抵抗肠蠕动或尿液的冲洗作用而有利于定居，一旦丧失菌毛，其致病力亦随之消失。许多细菌导致人类疾病,菌毛介导粘附到宿主细胞是哺乳动物感染的第一步。经常引发细菌粘附的细胞骨架的重排。细菌可以通过自然哺乳动物宿主信号转导通路为吞噬作用准备宿主骨架。bact

6、eriaAfimbrial adhesins on the cell surfaceAfimbrial Adhesins鞭毛（霍乱弧菌，百日咳杆菌，空肠弯曲菌），鞭毛（霍乱弧菌，百日咳杆菌，空肠弯曲菌），血凝素（霍乱弧菌，幽门螺杆菌），血凝素（霍乱弧菌，幽门螺杆菌），表面蛋白（志贺氏菌），表面蛋白（志贺氏菌），LTA（多数（多数G菌）菌）Used by many bacteria, particularly Gram (+)Individual proteins or clusters of protein on the cell surface mediate a tight interac

7、tion with host cells细菌细胞壁细菌细胞壁非菌毛粘附素的粘附机制壁磷壁酸参与细菌粘附的作用机理壁磷壁酸参与细菌粘附的作用机理:a.磷壁酸的游离端可以直接与宿主细胞的表面分子(受体)结合;b.磷壁酸分子本身带负电荷，可以与宿主细胞表面带正电荷的大分子或大分子的某些带正电区域结合;c.磷壁酸与细菌本身的表面蛋白结合，通过表面蛋白介导再与宿主细胞表面受体结合，此时的磷壁酸和蛋白质共同组成粘附因子。可见，壁磷壁酸在致病性方面具有重要意义。脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)粘附机制 a.LTA的重复单位及疏水链都含有脂质结合点，它们可以与宿主细胞表面的脂质区结合，特

8、别是一些糖脂及脂蛋白受体; b.细菌在生长过程中不断向周围释放LTA(或dLTA)，其中一部分LTA是游离的，而另一部分则通过链的亲水端与细菌表面蛋白结合，能与膜结合的疏水端则有机会同宿主细胞表面的脂质受体或蛋白质受体结合; c.LTA分子本身带弱负电荷，它的游离端可直接与宿主细胞表面带正电荷的大分子(或某一部分)结合，从而介导细菌的粘附。宿主细胞表面的特异性受体 宿主细胞的细胞膜 脂质双层：脂类、蛋白质 细胞表面的粘附受体 整合素、钙粘蛋白、免疫球蛋白超家族、选择素 ECM(extracellular,matrix) 由细胞产生和释放的大量分子构成细胞外复杂的结构网，包括纤连蛋白、纤维素蛋白

9、原、胶原蛋白、蛋白聚糖和粘多糖粘附素与相应受体细菌的特异性粘附机制 直接粘附 间接粘附-经由ECM蛋白的粘附 EPEC粘附细菌粘附实验模型细菌粘附实验模型动物模型动物模型粘膜上皮组织体外粘附粘膜上皮组织体外粘附模型模型细胞模型细胞模型细菌粘附研究实验方法动物模型 是细菌粘附研究中应用最早最广泛的实验模是细菌粘附研究中应用最早最广泛的实验模型，可选普通动物，型，可选普通动物，SPF 动物，动物，GF动物。动物。 形成动物模型的条件中，外因包括所用细菌形成动物模型的条件中，外因包括所用细菌浓度、实验步骤、动物机体的免疫状态，内浓度、实验步骤、动物机体的免疫状态，内因动物的品种、细胞的受体系统和选用

10、菌株因动物的品种、细胞的受体系统和选用菌株的特性。的特性。 细菌粘附动物模型应用过细菌粘附动物模型应用过程中可长时间观察细菌的程中可长时间观察细菌的粘附作用，也可用于短期粘附作用，也可用于短期观察。长时间观察可通过观察。长时间观察可通过定期检测动物排泄物中攻定期检测动物排泄物中攻击菌的数量间接反映细菌击菌的数量间接反映细菌的粘附的粘附;短期观察通过将短期观察通过将动物急性处死后，通过对动物急性处死后，通过对粘附与粘膜上皮表面的细粘附与粘膜上皮表面的细菌进行扫描电镜观察或进菌进行扫描电镜观察或进行细菌培养计数来确定细行细菌培养计数来确定细菌在粘膜上皮表面有无粘菌在粘膜上皮表面有无粘附及粘附能力的

11、强弱。附及粘附能力的强弱。细胞模型 近年来应用较多的一类细菌粘附模型，具有近年来应用较多的一类细菌粘附模型，具有重复性好和周期短的优点，如重复性好和周期短的优点，如Hela细胞（人细胞（人子宫宫颈癌上皮细胞）子宫宫颈癌上皮细胞） Int407407 细胞细胞(人胚胎人胚胎肠粘膜细胞系肠粘膜细胞系)Vero细胞（非洲绿猴肾异倍细胞（非洲绿猴肾异倍体细胞）体细胞） CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）细胞（中国仓鼠卵巢细胞）等。等。由于这些细胞系多为来自肿瘤细胞的无限由于这些细胞系多为来自肿瘤细胞的无限繁殖细胞系已失去某些细胞表面的受体标志，繁殖细胞系已失去某些细胞表面的受体标志，现在开始采用原代培养细

12、胞作为细胞粘附模现在开始采用原代培养细胞作为细胞粘附模型用细胞。型用细胞。粘膜上皮组织体外粘附模型 为近年来受到重视的一类细菌粘附模型，此为近年来受到重视的一类细菌粘附模型，此模型可避免动物模型中各种干扰因素的影响，模型可避免动物模型中各种干扰因素的影响，方便、重复性好为一类能直接反应细菌粘附方便、重复性好为一类能直接反应细菌粘附素与细胞表面受体相互作用的理想模型。素与细胞表面受体相互作用的理想模型。粘膜上皮组织选择的原则：粘膜上皮组织选择的原则：.受体特异性受体特异性原则原则.年龄选择，月龄以上胎儿的胃年龄选择，月龄以上胎儿的胃肠道粘膜上皮组织表面的大部分受体系统才肠道粘膜上皮组织表面的大部

13、分受体系统才能充分表达。能充分表达。.部位选择，细菌对同一组部位选择，细菌对同一组织器官不同部位粘膜上皮组织的粘附能力有织器官不同部位粘膜上皮组织的粘附能力有较大差异较大差异。 粘膜上皮组织体外模型的应用注意事项：粘膜上皮组织体外模型的应用注意事项：.粘膜上皮组织片的制备，先将上皮组织均粘膜上皮组织片的制备，先将上皮组织均匀展平后用固定，粘膜上皮片组织匀展平后用固定，粘膜上皮片组织片大小要均匀。片大小要均匀。.细菌活力的维持。细菌活力的维持。.非特异性粘附的减少或避免非特异性粘附的减少或避免 。Section twoInvasion(internalization) Obtaining nut

14、rients Avoid host defenses指某些毒力强或具有侵袭能力的病原菌主动侵入非指某些毒力强或具有侵袭能力的病原菌主动侵入非吞噬细胞吞噬细胞（主要为粘膜上皮细胞）（主要为粘膜上皮细胞）的感染过程。的感染过程。侵袭素：侵袭素： Entry Intracellular life-style The vacuole as an intracellular replication compartment Life in the cytosol and actin-based intra- and intercelluar motility Cell responses to intra

15、cellular pathogensBacterial InvasionSteps in bacterial invasionThe Zipper Mechanism of EntryThe Trigger Mechanism of Entry一、一、Entry MechanismsEntry MechanismsAlicia E. Smith and Ari Helenius Science 304 237 (2004)The Zipper Mechanism of Entry：Contact and adherencePhagocytic cup formationthree succes

16、sive stepsreceptor clusteringActin polymerizationMembrane extensionTransient signalstriggerPhagocytic cup closure and retraction, and actin depolymerization配体介导的内化配体介导的内化拉链式拉链式Zipper model for invasin-mediatedBacteriumIntegrin receptorsECMActinNot sufficient receptors for internalization of bacteria

17、 because most of theb b1-integrin population is bound to ECM.Zipper model for invasin-mediatedBacteriumECMActinIntegrin receptorsbut due to high affinity binding of invasin to integrins the receptors are sequestred and the bacteria begins to be internalizedZipper mechanism耶尔森氏菌Yersinia侵袭素侵袭素Invasin

18、-整合素整合素Integrin李氏杆菌Listeria内化素内化素Internalin -钙粘连蛋白钙粘连蛋白 E cadherinInlB-Met Graphic of the Yersinia uptake mechanism（A）“拉链”机制，主要见于耶尔森菌和李斯特菌； （B）“触发”机制，主要见于沙门菌和志贺菌。排排他他性，性，个个体体行行为为The Zipper Mechanism of Entry：配体介导的内化配体介导的内化Entry MechanismsEntry MechanismsAlicia E. Smith and Ari Helenius Science 304 2

19、37 (2004)The Trigger Mechanism of Entry：信号转导的：信号转导的细胞膜皱变细胞膜皱变Four successive stepspre-interaction stageinteraction stageformation of a macropinocytic pocketActin depolymerization and closing of the macropinocytic “巨胞饮” pocketEffector moleculesDedicated chaperonesThe formation of a signaling platform

20、avoid premature association of the effector molecules and their proteolytic degradationLocalized but massive rearrangement of the cell surfaceCharacterizations:The formation of intricate filopodial and lamellipodial structures触发式触发式Trigger mechanismSalmonella SPI-1 Type III secretion system “trigger

21、s” invasion顶面（api-cal surface）ShigellaMxi-Spa Type III secrection system “triggers” invasion基底面（basolat-eral face）M cells: the weak point of the intestinal epitheliumMembranous epithelial cells (M cells) are key sites of antigen sampling for the mucosal-associated lymphoid systemCossart and Sansonet

22、ti, Science 2004Model of invasion of the intestinal epithelium by SalmonellaInvasion of the intestinal epithelium by ShigellaCossart and Sansonetti, Science 2004兼兼容容性，性，群群体体行行为为The Trigger Mechanism of Entry：信号转导的细胞膜皱变：信号转导的细胞膜皱变in vitro invasion and in vivo invasion experiment Cell model：粘附试验：粘附试验：1.培养细胞于培养细胞于 24 孔细胞培养板（内置载玻片）孔细胞培养板（内置载玻片） 2.加入细菌（计数，标记），培养加入细菌（计数，标记），培养 1 . 5 h 3.用用 Hanks 液洗液洗 6 次次 4.加入含加入含 1 %TritonX - 100 的的 PBS 10min 5.吸出各孔悬液吸出各孔悬液 , 稀释稀释 , 倾注培养基，培养倾注培养基，培养,计数菌落数。计数菌落数。细菌侵袭实验：细菌侵袭实验：1.培养细胞于培养细胞于 24 孔细胞培养板（内置载玻片）孔细胞培养板（内置载玻片） 2.加入细菌（