影响猪卵母细胞体外成熟的相关因素

1、影响猪卵母细胞体外成熟的相关因素张 莉，冯书堂（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，基因与细胞工程研究室，北京 100094）摘要：卵母细胞是胚胎工程和发育生物学的重要组成部分，它是体外受精、性别控制、克隆及转基因等技术成功与否的前提和关键。影响猪卵母细胞体外成熟的因素很多，本文将从物理因素和化学因素两方面作简要综述。关键词：猪；卵母细胞；体外成熟；物理因素；化学因素Factors with in vitro Maturation of Porcine OocytesZHANG Li，FENG Shu-tang（Department of Gene and Animal Cell Enginee

2、ring, Institute of Animal Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100094）Abstract: Oocyte in vitro maturation plays an important role in embryonic engineering such as in vitro fertilization, nuclear transfer, sex control, cloning and gene transfer. The in vitro maturation of porcin

3、e oocytes is the crucial step and precondition in embryo production. It is affected by various factors. In this study, physical and chemical factors in vitro maturation of porcine oocytes are discussed. Key words: Porcine; Oocyte; in vitro maturation; Physical factors; Chemical factors猪胚胎工程已极大地推进了畜牧

4、业和医学的进程，通过它可以改良品种、培育抗病猪种、提高肉质、生产转基因猪或基因组修饰猪、制备人类疾病模型、进行器官移植、生产药物蛋白、研究发育机理等。卵母细胞体外成熟是胚胎工程和发育生物学的重要组成部分，是胚胎体外生产的上游环节，其质量的优劣和成熟率很大程度上决定了后期的结果。体外卵母细胞无论是成熟还是受精后支持发育的能力都比体内差，这说明体外成熟培养环境还远未达到体内的生理水 平1。影响猪卵母细胞体外成熟的因素很多，本文拟通过综述物理因素和化学因素，以期和同行们共同探讨，摸索猪卵母细胞体外成熟的最佳培养体系和条件，为猪胚胎工程提供技术。1 物理因素1.1 卵巢来源猪的品种、年龄及健康状况猪的

5、品种、年龄及健康状况不同，其卵母细胞的质量和体外成熟培养的效果亦不同。一般来讲，不同国家和地区，猪种之间都会存在因遗传背景、特定的气候条件、饲养环境及方式和营养水平的不同而造成品种品质上的差异，从而导致卵母细胞质量的差异2。而从同一品种猪抽取不同猪的卵泡卵母细胞，其培养效果也会因为各个猪的年龄、健康状况、卵巢形态的不同而不同。比如，处在育龄盛期的健康成年母猪，其卵巢体积大，有黄体，颜色也较深，卵巢表面卵泡多而且直径在36 mm的卵泡所占比例相对较高，抽得的卵母细胞形态完好，裸卵少，体外成熟培养效果也好。反之，取自仔猪、青年猪、老母猪及老弱病残猪的卵母细胞体外成熟培养效果较差。1.2 卵巢离体时

6、间通常情况下，卵巢离体时间越短越好，也就是尽可能及早地将卵母细胞抽出进行培养，目前比较公认的卵巢离体时间应在34 h之内。但实际上，因为各种主观和客观因素的限制，卵巢离体时间往往超过3 h以上，这就使卵母细胞的生存环境受到一定的应激，从而影响其进一步发育。文国艺等报道3，母猪卵巢离体时间的长短直接影响卵母细胞的体外成熟及卵裂率，卵裂率将随着卵巢离体时间的增加呈降低的趋势。 1.3 卵巢回收温度不同于其它哺乳动物，猪卵子对温度特别敏感，如果送回实验室的卵巢温度过高或过低，都会影响卵母细胞的体外成熟培养效果，一般比较适宜的卵巢送达温度范围是3235。夏季室内外温度都较高，因此温度相对容易控制；但冬

7、季的昼夜温差大，室内外温度也较低，因此，卵巢温度的控制就显得尤为重要。文国艺研究了卵巢保存温度对猪体外受精的影响3，发现当卵巢回收温度低于25，猪的卵母细胞将受到低温应激；温度还将通过影响猪卵母细胞的体外成熟继而影响到体外受精，当卵巢回收温度为3639、2528、1417时，猪体外受精的卵裂率分别为52.3%、49.8%、28.8%。1.4 卵巢的质量及卵泡的大小采自不同或相同卵巢上卵泡的大小都不一样，目前将卵巢卵泡按直径大小分成3类：3 mm以下、36 mm和6 mm以上。几乎所有的试验都表明来自直径36 mm的卵泡中卵母细胞的形态最好，培养效果也最好。1.5 猪卵母细胞体外培养体系1.5.

8、1 体外培养条件 不同动物卵母细胞体外成熟所需的最适湿度、温度和气相都不尽相同。目前，猪卵母细胞体外培养条件大多采用3839，5% CO2，饱和湿度。当然，也可根据不同的试验设计来调整某些指标。1.5.2 卵母细胞的选择 形态良好的卵母细胞被颗粒细胞完整包被，其成熟率随颗粒细胞包被层数的增加而增加。因此，卵丘细胞的完整性对卵母细胞体外成熟具有重大意义。绝大多数实验室在进行猪卵母细胞体外成熟试验时，除非从卵母细胞的形态方面做对比，一般都选择卵母细胞胞质均匀、卵丘致密的卵母细胞，因为卵母细胞胞质不均匀和卵丘细胞少的卵母细胞在培养后退化很严重。佐腾英明4认为，扩展的卵丘细胞能调节物质的通透性，诱捕卵

9、母细胞排出的有害物质，从而有效地抑制卵母细胞的死亡和退化。研究表明，卵泡直径>6 mm的卵泡和卵泡直径在36 mm的卵泡中的卵母细胞更易于成熟和排出第一极体，但在卵泡直径>8 mm的卵泡中有些卵母细胞有严重退化的现象5。此外，在牛的卵母细胞体外成熟培养中，Sirard6得出卵泡直径>6 mm的卵泡卵母细胞的成熟率低于卵泡直径在36 mm的卵泡卵母细胞的成熟率。因此，在进行猪卵母细胞体外成熟培养的试验中，一般都选用卵泡直径在36 mm的卵泡卵母细胞，这也是目前众多学者一致认同的。1.5.3 成熟培养时间 不同动物卵母细胞体外成熟培养所需的时间也不同，多数哺乳动物的卵母细胞体外成

10、熟的培养时间通常在2224 h，而猪卵母细胞比较特殊，通常需要48 h左右才能达到核成熟，在24 h的核成熟率几乎为零。Yoshida7认为猪卵母细胞体外培养时间不能低于30 h，30 h之前成熟率随培养时间增加而迅速上升，30 h后成熟率随培养时间增加而缓慢上升，猪卵母细胞培养36 h和42 h的成熟率无显著差异，但显著低于46 h的成熟率。Sosnowki等8研究了不同培养时间对猪卵母细胞体外成熟的影响，发现4048 h培养与3036 h培养成熟率差异显著（92.2% vs 61%），但是通过染色体核型分析发现，随着培养时间的增加，染色体异常率有所增加，这是一个不可避免的矛盾。此外，体外培

11、养4872 h虽可获得较高的成熟率，但大部分成熟卵母细胞已处于退化阶段。因此，在保证一定核成熟率的前提下，有必要缩短猪卵母细胞体外成熟培养时间。世界首例转基因克隆猪的成熟培养时间选择4446 h（Lai Liangxue et al，2002）。本实验室采用4244 h作为猪卵母细胞体外成熟培养的适宜时间。 2 化学因素2.1 激素激素是哺乳动物卵母细胞成熟的重要物质，它们在体内调节卵母细胞成熟的作用机理研究得比较多。目前，大多数实验室在猪的卵母细胞体外成熟培养液中，都添加促性腺激素或类固醇激素或两者的混合物，在体外成熟培养过程中，不同阶段可能有不同的激素需要。 2.1.1 促性腺激素的影响

12、卵母细胞的成熟往往伴随卵泡的成熟，卵子的成熟要受到促性腺激素和性腺激素的影响，但卵子在体外可以不受内分泌的影响而达到成熟。促卵泡素（FSH）和促黄体素（LH）是参与卵泡发生的最主要的蛋白质激素，它们与颗粒细胞、内膜细胞上的受体结合并激活cAMP（环腺苷酸）系统，提高细胞中参与类固醇合成的一系列酶的活性，导致类固醇激素尤其是雌二醇（E2）的合成及其在血液与卵泡液中浓度的增加，从而促进卵泡卵母细胞的生长和发育。在以往的试验中，科研工作者通过在培养液中添加促卵泡素（FSH）和促黄体素（LH）来促进卵母细胞的成熟，后来又用PMSG和hCG代替，都得出了它们能提高卵母细胞成熟率的结果。FSH或LH或两者

13、的混合物能促进卵母细胞体外成熟。Brackett等在1988年首次提出在卵母细胞培养基中加入LH能促进卵母细胞体外成熟并能促进其以后的体外受精及胚胎的体外发育，同年Zhang9也得到了相同的结果。国内旭日干10研究表明，添加LH或hCG，受精率和卵裂率明显高于未添加者，但无显著差异。Funahashi、孟庆刚、蔡令波等研究表明，含有PMSG的成熟培养液可同时诱导猪卵母细胞的核成熟和卵丘细胞的扩散1113。许多试验还表明在培养液中添加激素可以提高卵母细胞核成熟，排出第一极体。2.1.2 类固醇激素的影响 在体外成熟培养中，雌二醇对卵母细胞的影响结果不尽相同,能否对卵母细胞的成熟具有促进作用仍有争

14、议。雌二醇有利于人卵母细胞的胞质成熟14，但在许多其它动物的研究结果并非如此，在FSH存在的情况下，E2的添加并不能促进牛卵母细胞的成熟15。江金益16也认为雌二醇对卵母细胞体外成熟的作用优于促性腺激素。在猪卵母细胞的体外培养中，在前24 h添加促性腺激素和雌二醇，后24 h去除激素，不但能提高卵母细胞的成熟率，而且有利于卵母细胞的受精和发育17,18。2.1.3 生长因子 研究表明，发育卵泡中存在多种促生长因子及其受体，它们同时影响卵膜细胞和颗粒细胞的增殖和分化，并参与调节卵母细胞的成熟。颗粒细胞一旦开始增殖分化，就分泌大量的细胞因子, 如表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bF

15、GF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子（TGF）、白细胞介素（IL）、神经生长因子（NGF）、干扰素-r（LFN-r）、抑制素和活化素等19，这些因子对卵母细胞的生长起决定作用。在猪的卵母细胞体外成熟培养中，使用较为广泛的是表皮生长因子、转化生长因子等。EGF广泛存在于人和动物的尿液、乳汁和血浆中。它是具有多功能效应的一个很强的促细胞分裂因子，可刺激多种细胞在体内和体外的增殖作用，在刺激静止细胞进入S期的同时，伴随着糖的运输、阳离子的流动、氨基酸的转移增加等多种生物学效应。现已证实，EG

16、F能诱导猪卵母细胞卵丘膨胀和促进核成熟20。Abeydeera21的研究试验表明，EGF能促进卵母细胞成熟过程中蛋白质的合成，提高卵母细胞质的质量，添加EGF培养成熟的卵母细胞受精后的发育能力更强。TGF-在结构和功能上与EGF相似，它也可以和EGF受体结合，可以诱导猪卵丘细胞扩散，促进卵母细胞核成熟22。IGF对细胞具有促分裂、分化、促代谢和抗凋亡等生物学功能。IGF-1是一个独特的既能刺激生长又能促进分化的多肽，是具有多种生理功能的生长因子，它同样能促进猪卵母细胞的体外成熟，而且能增加所得胚胎的发育能力23。胰岛素在高浓度时可以结合IGF-1的受体，也可以增加猪体外成熟卵母细胞的受精率和卵

17、裂率。NGF是一种能促进某些神经细胞存活的可溶性多肽，在正常神经系统发育、分化及维持神经原特殊功能中具有重要作用，它能使感觉神经节及交感神经节数目增加，体积增大，能促进触突延伸，诱导产生细胞分化表型。NGF也是卵母细胞成熟过程中的重要调节物质之一，它对卵母细胞核、质成熟的促进作用目前还未证实，但它能影响猪卵母细胞成熟的动力学，加快进入M期的速度。此外，PDGF也是一种较强的促有丝分裂因子。已被证实，大多数二倍体细胞在增殖过程中需要PDGF，特别是在静止细胞被刺激进入增殖的过程中。PDGF与EGF在卵母细胞体外成熟能明显提高卵泡的形成，能提高卵裂率和桑椹胚的形成。VEGF是一种特殊的细胞分裂剂和

18、潜在的血管分化因子，可以促进内皮细胞的增生、促进细胞的迁徙以及抑制细胞凋亡并提高血管的通透性和微血管对大分子物质的通透性。VEGF能显著提高卵丘细胞的扩展，影响卵母细胞的核和质成熟，促进卵母细胞的体外成熟，并由此导致体外受精率和促进胚胎的发育。2.2 抑制或促进卵母细胞成熟的两种因子2.2.1 卵母细胞成熟抑制因子（OMI） OMI是指卵泡液中能够抑制卵母细胞成熟的物质。卵泡液中的OMI可能包括一些低分子量的热稳定多肽、环腺苷酸或卵巢固醇类物质24。现已证实它是由颗粒细胞释放到卵泡液中发挥作用的。目前有两种重要的成熟抑制因子：环核苷酸和嘌呤。在体外，通过抑制磷酸二酯酶活性阻止细胞内cAMP降解

19、或是通过激活腺苷酸环化酶升高细胞内cAMP的试剂，都可以抑制卵母细胞的成熟28。因此，卵母细胞中的cAMP是控制减数分裂阻滞的重要分子，同时它也能抑制GVBD的发生。Tsafriri等在1975年就发现猪卵泡液中有抑制GVBD发生的物质，后来证实这种物质就是次黄嘌呤（HX）。在培养液中加入一定浓度的次黄嘌呤和腺苷就能抑制多种动物卵母细胞自然成熟，这两种物质对维持减数分裂阻滞有协同作用25，并与卵母细胞内cAMP水平直接相关。2.2.2 卵母细胞促成熟因子（MPF） 从正在进行减数分裂的卵母细胞中可以提取一种引发GVBD的物质，称它为成熟促进因子（MPF）或M期促进因子。MPF是由Cyclin

20、B 和p34cdc2两种蛋白组成的复合体，它以非激活的前体物质存在于成熟前的卵母细胞中。向未成熟的卵母细胞中显微注射MPF可引起GVBD。Cyclin B随着细胞周期的变化周期性的产生，在分裂间期这种周期蛋白不断积蓄，超过激活MPF的临界值，在分裂后期这种蛋白降解造成MPF复合体的失 活26。MPF前体转化为MPF需p34cdc2去磷酸化。而Cyclin B不仅是MPF的调节亚基，而且还可以直接激活与MPF激活有关的cdc25酪氨酸磷酸酶。MPF活性对于启动卵母细胞减数分裂，维持减数分裂中期的静止，以及促使M向M的转变具有促进作用，此外，MPF复合体还参与卵母细胞减数分裂过程中核膜的破碎27。

21、2.3 血清血清是一种非常复杂的混合物，它的大部分组分已为人所知，但还有一部分尚不清楚。越来越多的研究证实，血清能够促进原始卵泡卵母细胞生长启动，并提供生长所需的一种或几种因子，培养液中添加动物血清可促进卵母细胞成熟。在猪的卵母细胞培养中，应用得最广泛的是牛血清。近年来，许多研究者又在猪的卵母细胞成熟培养液中添加一定比例的猪血清，其中包括：新生仔猪血清，母猪发情的血清等。Sanbaissho 28指出，添加发情母牛血清或犊牛血清，卵母细胞的成熟效果好于添加牛血清白蛋白。Leibfried29指出，培养液中犊牛血清的最适宜添加量是10%，这与其后江金益的 30研究结果一致。现在大多数实验室也都是

22、采用在猪的卵母细胞体外成熟培养液中添加10%的胎牛血清。Nakanishi 31发现，添加新生仔猪血清猪卵母细胞的成熟效果最好，成熟率最高达80%；胎牛血清次之，成熟率为53.9%；去势公猪血清最差，成熟率仅为50%。2.4 卵泡液(PFF)的作用卵泡液是卵母细胞体内发育的介质，它由血浆渗出液和卵泡细胞分泌物组成，含有大量来自血清的生化因子和卵母细胞及卵泡细胞的分泌因子。卵泡液作为卵母细胞发育的微环境对其成熟具有重要的调节作用，主要表现在提高卵母细胞质成熟的质量，增加胚胎的发育能力32。现在研究者已先后从猪、牛、鼠卵泡液中分离出了卵母细胞减数分裂抑制剂，即 OMI 。Naito 33

23、、Meinecke34 、Tsafriri35 、Sato36都证明猪卵泡液中含有抑制卵母细胞成熟的物质。但也有一些研究者认为卵泡液对卵母细胞的体外成熟没有抑制作用37。Naito 33报道：在体外，猪卵泡液可促进猪卵母细胞胞质成熟，从而显著提高卵母细胞受精后的原核形成率，但这种作用不能被促性腺激素和类固醇激素所代替。因此，在卵母细胞的体外成熟培养中，都要添加一定比例的卵泡液，以促进卵母细胞胞质成熟。2.5 Ca2+及钙调素细胞内游离Ca2+可以作为一种内在的第二信使信号参与调节哺乳动物卵母细胞的减数分裂成熟。研究表明，在卵母细胞成熟分裂过程中细胞内游离钙离子浓度有自发的波动38，这些波动与卵

24、母细胞的胞质成熟有密切的联系。Ca2+浓度的升高是减数分裂中一个不可缺少的中间过程，一定浓度的Ca2+-CaM复合体抑制剂能抑制GVBD39。 2.6 巯基物质有研究表明，含巯基的物质如半胱氨酸、谷胱甘肽、谷氨酰胺、巯基乙醇等对猪的卵母细胞的胞质成熟有明显的促进作用40。这些物质不但可以清除卵母细胞内的氧自由基，而且在细胞分裂时作为二硫键断裂的供氢体。卵母细胞成熟培养液中添加较多的是半胱氨酸，有试验表明，M199成熟培养液中添加半胱氨酸可以显著提高卵母细胞发育后期的卵裂率，其卵裂率分别为添加前15.7%，添加后30.6%41 。由此可见，卵母细胞体外成熟受到众多因素的调控，其调控机制也十分复杂

25、。作为一项非常有发展前途的生物技术和畜牧业实用技术，研究重点仍需放在如何通过改进影响卵母细胞体外成熟的各种影响因子来提高其成熟率及后期的胚胎发育质量，尤其是近期中国农业大学也成功得到中国第1头、世界第7头体细胞克隆猪后42，更让同行们看到了卵母细胞体外成熟这一技术在胚胎工程中的重要性，同时也说明了注重和改进卵母细胞成熟影响因素的可行性和必要性。References1 Sun Q Y, Nagai T. Molecular mechanisms underlying pig oocyte maturation and fertilization. Reproduction Development

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