牛奶中恩诺沙星和环丙沙星检测试纸的研制及性能测定

1、牛奶中恩诺沙星和环丙沙星检测试纸的研制及性能测定何丹婷 , 李艳伟 , 师 伟 , 赵 宁 , 徐 飞(北京市维德维康生物技术有限公司 , 北京 100085收稿日期 20110526文献标识码 A 文章编号 10021280(2011 09003604中图分类号 S85984摘 要 应用胶体金免疫层析技术建立了恩诺沙星和环丙沙星快速检测试纸 , 并对试纸条的检测限 、特异性和稳定性等参数进行了确定 。 结果表明 , 该试纸条对牛奶样本的检测限为 50g /L, 能够特 异性地检测恩诺沙星和环丙沙星 , 与液相色谱 串联质谱方法检测的阴性样本符合率为 978%。 该试 纸条在 2 8 或室温可

2、保存 12个月 , 可应用于恩诺沙星在牛奶中的快速筛查现场检测 。 关键词 恩诺沙星 ; 胶体金免疫层析技术 ; 快速检测试纸基金项目 :农业科技成果转化资金项目 (2010GB2A000009作者简介 :何丹婷 (1984年 , 硕士 , 从事动物源性食品安全检测技术研究 。 E mail :dantinghesinacom 通讯作者 :徐 飞 。 E mail :aaaxufeiyahoocomcnResearch and Trait Identification of Colloidal Gold Strip for RapidDetection of Enrofloxacin and

3、Ciprofloxacin in MilkHE Dan ting , LI Yan wei , SHI Wei , ZHAO Ning , XU Fei(Beijing WDWK Biotechnology Co, Ltd , Beijing 100085, China Abstract :The rapid test strip for detection of enrofloxacin and ciprofloxacin was developed based on colloidal gold immune chromatographic technology ,and its tech

4、nical parameters , such as sensitivity , specificity and stability were tested respectivelyThe results showed that the LOD of the strip was 50g /Land was specific forenrofloxacin and ciprofloxacin detectionThe coincidence rate of negative samples was 978%compared with LC MS /MSThe rapid test strip c

5、an be stored at 2 8 or room temperature for at least 12months and be applied for rapid enrofloxacin screening in milkKey words :enrofloxacin ; gold immune chromatographic assay ; rapid test strip 恩诺沙星 (Enrofloxacin 与环丙沙星是属于喹 诺酮类化学合成的抑菌剂 , 广泛应用于畜禽和水产 养殖中支原体和细菌性疾病预防与治疗 , 但长期使 用会造成组织中药物残留而影响人类健康 , 因此对

6、恩诺沙星和环丙沙星的检测分析具有良好的经济效益和重要的社会意义12。 国内外已有微生物 法 、 色谱法 、 电化学法和免疫分析法研究的报道 。本文应用制备的恩诺沙星的单克隆抗体 (mAb 和 胶体金免疫层析技术 (GICA 研制出残留快速检测胶体金试纸 , 以期为基层大规模的初筛提供快速 、简便的检测方法 。 1材料与方法 11材料 111实验仪器Biodot 喷膜机 , 美国 Biodot 公司产品 ; 恒温电磁搅拌器 , 国华电器 ; 切条机 , 上海韩港电子科技 ; 电热恒温培养箱 , 天津中环 。 112试剂和动物氯金酸 、 柠檬酸三钠等化学 试剂 , 北京化学试剂公司 ; 恩诺沙星等

7、各种交叉反应药物为常规标准品 , DrEhrenstorfer Gmbh 公司 产品 ; 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA 、 卵 清 蛋 白 (OVA , Sigma 公 司 ; 羊 抗 鼠 IgG , 为 美 国 Jackson Immune Research 公司产品 ; 包被原由北京市维德维康生物 技术有限公司制备 。Balb /c小鼠和新西兰大白兔 , 国家兽药安全评 价中心实验动物房提供 ; 人工抗原 CIF BSA (分子 结合比为 11 1 、 分泌恩诺沙星特异性抗体细胞株 (编 号 ENR5F1 、 腹 水 抗 体 (间 接 ELISA 效 价 1 256 105 、 抗体亚

8、型 IgG1, 均为北京市维德维 康生物技术有限公司制备保存 。12方法 35121胶体金制备和质量鉴定 采用柠檬酸三钠 还原法制备胶体金 , 方法参见文献 69。122金 标 抗 体 的 制 备 和 纯 化 01mol /LK 2 CO3调节胶体金溶液 pH 值至 82, 将 10mL 胶体金 溶 液 加 入 50mL 烧 杯 中 , 电 磁 搅 拌 器 250 r /min搅拌 , 逐滴加入 1mL 含 035mg 恩诺沙星抗 体蛋白溶液 。 逐滴加入 3mL 5%BSA , 持续搅拌 10min 。金标抗体溶液常温低速 (1500r /min 离心 20 min , 弃去由凝聚的金颗粒形

9、成的沉淀 。 红色上清 溶液 2 8 , 11000r /min离心 40min 。 溶液 分为三层 , 透明上清 、 管底可流动的暗红色沉淀及 管底壁上黑色致密的金颗粒层 。 将可流动的暗红 色沉淀转移到另外一个离心管中 , 用含 1%BSA 的 001mol /L磷酸盐缓冲溶液 (PB 混悬至原量 。 平 衡过夜 , 同上重复离心 2次 。 最后用 1%BSA 的 001mol /LPB (含 002%叠氮钠 将沉淀混悬为原 体积的 1/40, 2 8 保存 。123胶体金免疫层析试纸的制备 用玻璃纤维 XYZ3050Biodot 三维喷点平台系统以 8L /cm将 胶体金标记的恩诺沙星单

10、克隆抗体点喷在玻璃纤 维上 , 37 烘干 30min ; 用 XYZ3050三维喷点平台 系统以 08L /cm将抗原 (05mg /mL 点喷在硝 酸纤维素膜上 , 即为检测线 ; 在离检测线 4mm 处喷 上羊抗鼠 IgG (08mg /mL , 即为质控线 , 37 干 燥 2h 。 在塑料背板上依次粘贴样品垫 、 结合释放 垫 、 硝酸纤维素膜 、 吸收垫 , 并在样品垫外面粘贴保 护膜 。124待检样品的处理与结果判定 取新鲜原奶 样品 600L , 加入样品稀释液混匀后 , 80 水浴 2 min 后 , 用滴管取 6 8滴滴于样品孔中 , 5min 后判 定结果 。 若样品为阴

11、性 , 加样后在 T 区出现一条紫 红色条带 ; 若样品为阳性 , 则 T 区不会出现紫红色 条带 。 无论样品中有无恩诺沙星存在 , C 区都会出 现一条紫红色条带 。125胶体金免疫试纸检测限的测定 用阴性牛 奶配制恩诺沙星和环丙沙星的标准溶液 , 终浓度分 别为 10、 25、 50、 75、 100g /L, 按要求对样品处理后 进行检测 , 每份样品重复 5次 , 5min 后目测判断 结果 。126胶体金免疫试纸特异性的测定 取恩诺沙 星 、 环丙沙星 、 氧氟沙星 、 氟甲喹 、 诺氟沙星 、 二氟沙 星 、 达氟沙星 、 四环素 、 链霉素 、 阿维菌素标准品 , 进 行交叉反

12、应率的测定 , 确定试纸条的特异性 。 127胶体金免疫试纸稳定性的测定 取三个不 同批次的胶体金试纸 , 分别置于 2 8 和室 温 , 于保存的第 0、 1、 3、 6、 9、 12个月取出 , 用阴性牛 奶配制恩诺沙星的标准溶液 3份 , 终浓度为 25、 50、 75g /L, 按要求对样品处理后进行检测 , 每份样品 重复 5次 , 5min 后目测判断结果 。128假阳性率的测定 取经 LC MS /MS确证 的阴性牛奶 50份 , 编号为 1# 50#。 按要求对样品 处理后进行检测 , 每份样品重复 5次 , 5min 后目测 判断结果 。129假阴性率的测定 取经 LC MS

13、 /MS确证 的阴性牛奶 120份 , 按农业部第 235号公告规定的 检测限浓度 (100g /L 添加恩诺沙星和环丙沙星 各 60份 , 按要求对样品处理后进行检测 , 5min 后 目测判断结果 。1210仪器比对 取 50份空白牛奶样品 , 随机 添加恩诺沙星标准品 , 制成 50份盲样 。 分别采用 胶体金免疫试纸和液相色谱 串联质谱 (LC MS / MS 两种手段进行测定 , 依照下面公式计算阴性样 本的符 合 率 。 仪 器 方 法 参 照 GB /T213122007 动物源性食品中 14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱 质谱 /质谱法 所述进行操作 10。 阴性样本符合率

14、=LC MS /MS阴性样本检出数 100%。 2结 果21胶体金免疫试纸检测限 从表 1的结果可以 看出 , 恩诺沙星及环丙沙星添加浓度为 50、 75、 100g /L时检测结果全为阳性 , 添加浓度为 25g /L时仅有一份恩诺沙星样品检测为阳性 , 因此本试纸 条在牛奶中恩诺沙星的检测限为 50g /L。表 1胶体金免疫试纸检测限的测定药物添加浓度 /(g ·L 1 10255075100+恩诺沙星 +环丙沙星 +22胶体金免疫试纸特异性 试纸条与喹诺酮类 主要药物及其他类药物交叉反应率的结果如表 2所示 。 测定的结果表明 , 胶体金试纸条与喹诺酮类 药物中除恩诺沙星和环丙

15、沙星外的其他喹诺酮类 药物的交叉反应率均不到 50%, 与四环素 、 链霉素 和阿维菌素不存在交叉反应率 , 因此胶体金免疫试 纸能够特异性地检测恩诺沙星和环丙沙星 。表 2试纸条与喹诺酮类主要药物的交叉反应率 药物 交叉反应率 /%恩诺沙星 1000环丙沙星 950氧氟沙星 368氟甲喹 296诺氟沙星 156二氟沙星 102达氟沙星 98四环素 01链霉素 01阿维菌素 0123胶体金免疫试纸稳定性 在空白牛奶样品 中 , 按照 25、 50、 75g /L三个浓度进行添加 , 每个 浓度添加 5份 , 用试纸条进行检测 , 试验结果如表 3所示 。 结果表明 , 恩诺沙星试纸条在保存于

16、2 8 或者室温条件下 , 可以稳定放置 12个月而不影 响检测能力 , 说明该试纸条的稳定性良好 , 保存期 可以长达 1年 。表 3胶体金免疫试纸稳定性的测定结果添加浓度2 825g /L50g /L75g /L室温 (25 2 25g /L50g /L75g /L第 0个月 5份阴性 5份阳性 5份阳性 5份阴性 5份阳性 5份阳性 第 1个月 5份阴性 5份阳性 5份阳性 5份阴性 5份阳性 5份阳性 第 3个月 5份阴性 5份阳性 5份阳性 5份阴性 5份阳性 5份阳性 第 6个月 5份阴性 5份阳性 5份阳性 5份阴性 5份阳性 5份阳性 第 9个月 5份阴性 5份阳性 5份阳性

17、5份阴性 5份阳性 5份阳性 第 12个月 5份阴性 5份阳性 5份阳性 5份阴性 5份阳性 5份阳性24假阳性率 对 50份 LC MS /MS确证的阴性 牛奶用胶体金免疫试纸测定 , 结果如表 4所示 。 结 果显示 50份阴性牛奶中仅有 1份样本用试纸结果 检测为阳性 , 通过计算得出 , 试纸条的假阳性率为 98%。表 4阴性牛奶样品测定结果样品编号 结果1# 10#11# 20#+21# 30#31# 40#41# 50#25假阴性率 按 100g /L终浓度添加恩诺沙 星至 LC MS /MS确证的 60份阴性牛奶中 , 编号 1 # 60#; 按 100g /L终浓度添加环丙沙星

18、至 LC MS /MS确证的 60份阴性牛奶中 , 编号 61# 120#, 试纸的检测结果如表 5所示 。 结果表明对 120份 添加的牛奶样本检测结果均为阳性 , 通过计算得 出 , 本试纸条的假阳性率为 0, 能够准确地检测出牛 奶样本中的恩诺沙星与环丙沙星 。表 5阴性牛奶样品测定结果样品编号 结果1# 10#+ 11# 20#+ 21# 30#+ 31# 40#+ 41# 50#+ 51# 60#+ 61# 70#+ 71# 80#+ 81# 90#+ 91# 100#+ 101# 110#+ 111# 120#+26仪器比对 分别采用仪器方法 11和试纸条 方法对 50份盲样进行测

19、定 , 阴阳性判断的临界值为 50g /L。 经 LC MS /MS测定 , 50份样品中有 45份为 阴 性 样 本 , 5份 阳 性 (3#、 21#、 26#、 38#、 41# 。 经试纸条测定 , 44份为阴性样本 , 6份为阳 性样本 (3#、 5#、 21#、 26#、 38#、 41# 。 试验结果表 明 , 本试纸条与 LC MS /MS检测阴性样本符合率 为 978%。3讨 论恩诺沙星属于小分子物质 , 采用竞争抑制法对 其进行检测 , 在建立方法时应特别注意对胶体金颗 粒的吸附量和包被抗原量的摸索 。 恩诺沙星单克 隆抗体在进行金标时 , 运用分光光度计测定法和目 测法来

20、选择胶体金与抗体之间的最适比 , 以减少目 测法时人为因素过多的干涉 , 使胶体金能与抗体最 大限度的结合 。农业部的 235号公告 12规定了恩诺沙星在牛 奶中的最高残留限量为 100g /L, 因此建立方法时 必须考虑设定合适的检测限 。 抗原的包被量过高 , 会使试纸条的灵敏度降低 ; 过低 , 会使在合格范围 内的被检样品判为不合格 。 通常基层使用胶体金 试纸作为初筛 , 筛选为阳性的结果 , 再用仪器进行 确诊 。 如果灵敏度过高 , 不仅增加了检测机构的工 作量 , 同时会造成牛奶生产者的损失 。公告同时也对牛羊的肌肉 、 脂肪和内脏组织中 恩诺沙星的最高残留限量做出了规定 ,

21、这需要在今 后的工作中摸索动物组织中恩诺沙星的提取方法 , 以使本试纸条有更广泛的应用 。参考文献 :1姜利英 , 谢小品 , 崔光照 , 等 动物性食品中喹诺酮类药物残 留检测方法的研究进展 J 郑州轻工业学院学报 , 2008, 4 (23 :142董志远 , 赵晓凤 , 宫秀杰 , 等 牛奶中氟喹诺酮类药物残留量 检测方法的研究 J 中国兽药杂志 , 2008, 42(10 :14163李忠秋 , 马 红 , 郭镇华 , 等 免疫胶体金技术基本原理及其在 疾病检测中的应用进展 J 黑龙江畜牧兽医 , 2006, 9:16184范国英 , 陈永耀 , 王顺岗 , 等 链霉素快速检测试纸条的

22、研制 及其性能测定 J 西北农业学报 , 2010, 19(2 :40445刘 烜 , 郑文杰 , 贺 艳 胶体金免疫层析法快速检测组织样品 中喹诺酮类药物残留 J 食品研究与开发 , 2009, 5:1311346李俊锁 , 邱月明 , 王 超 兽药残留分析 M 上海 :上海科学 技术出版社 , 20027吴永宁 , 邵 兵 , 沈建忠 兽药残留检测与监控技术 M 北 京 :化学工业出版社 , 20078Bassab C , Syamal RManufacturing High Quality Goldsol J IVD Technology , 2001, 8:46549杨利国 , 胡少昶 , 魏平华 , 等 酶免疫测定技术 M 南京 :南 京大学出版社 , 199810刘秀丽 三种检测牛奶中氟喹诺酮类药物残留方法的比较研 究 D 内蒙古 :内蒙古农业大学 , 200911GB /T213122007动物源性食品中 14种喹诺酮类药物残留 检测方法液相色谱 质谱 /质谱法 S 12中华人民共和国农业部第 235号公告 S 檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭