玉郎伞多糖对肝星状细胞氧应激脂质过氧化作用的影响

1、玉郎伞多糖对肝星状细胞氧应激脂质过氧化作用的影响        【摘要】     目的 研究玉郎伞多糖(YLS)对肝星状细胞（HSC）氧应激脂质过氧化作用的影响及机制。方法用H2O2诱导肝星状细胞脂质过氧化，测定细胞培养上清液中MDA，SOD水平，MTT法测定肝星状细胞的增殖，LDH法检测YLS对肝星状细胞的毒性作用，ELISA法测定I型胶原含量。结果YLS （25200g/ml）可明显降低培养上清液中MDA含量和I型胶原水平，抑制肝星状细胞的增殖，提高SOD活力，

2、并呈剂量依赖性。结论 YLS对肝星状细胞的增殖及I型胶原的合成具有抑制作用，该作用可能与其抗氧化作用有关。     【关键词】  玉郎伞多糖 肝星状细胞 I型胶原    The Effects of Yulangsan Polysaccharide(YLS) on the Proliferation and Collagen I Production of Hepatic Stellate Cell（HSC）Induced by Oxidative StressHUANG Biyi，HUANG Renbi

3、n，LU Xi， DUAN Xiaoqun1. Guilin People's Hospital Guilin 541001,China；2.Department of Pharmacology, Guangxi Medical University ,Nanning 530021,China；3.Guilin Medical College ,Guilin 541004,ChinaAbstract：ObjectiveTo study the effects and its mechanism of Yulangsan polysaccharide(YLS) on the prolif

4、eration and collagen I production of hepatic stellate cell（HSC）induced by oxidative stress. MethodsThe lipid peroxidation of HSC was induced by H2O2.The levels of malondialdehyde(MDA) and SOD in cultural supernatant were determined by general methods.Cytotoxicity was measured by LDH method.The proli

5、feration of hepatic stellate cells was measured by MTT method. The content of collagen I was measured by ELISA method.ResultsYLS （25200g/ml）concentration-dependently decreased the levels of MDA and collagen I and the number of proliferating HSC ，and increased the activity of SOD . ConclusionYLS can

6、inhibit the proliferation and collagen I production of hepatic stellate cell induced by oxidative stress. This might be associated with the anti-oxidative activity of YLS.Key words：Yulangsan polysaccharide；  Hepatic stellate cells；   Collagen I玉郎伞是一种尚未开发利用的民间草药，为蝶型花科植物疏叶岩豆 Millettia p

7、ulchra Kurz var.laxior(Dunn)Z Wei 的块根，具有散淤、消肿止痛之功能，民间用于高血压病、肝炎、消化不良等疾病的治疗。本课题组多年研究证实玉郎伞提取物具有抗氧化和免疫调节作用，并对急、慢性实验性肝损伤均有明显的保护作用1，2。玉郎伞多糖（Yulangsan  Polysaccharide，YLS）是玉郎伞提取物中主要的有效成分，为进一步研究YLS对肝纤维化的作用，本研究用H2O2诱导肝星状细胞脂质过氧化3，观察YLS对体外培养大鼠肝星状细胞增殖和I型胶原分泌的影响及机制，以探讨YLS抗肝纤维化的机制。1  材料与仪器1.1  细胞来源

8、肝星状细胞系为HSC-T6，为SV40转染SD大鼠HSC。1.2  药物及试剂 YLS，由本室自行提取（分离得到的YLS多糖经Sephadex-75凝胶柱层析，硫酸-苯酚法以及高效凝胶渗透色谱法证实为单一多糖，紫外扫描显示无核酸和蛋白特征吸收峰，薄层色谱和气相色谱表明由葡萄糖和阿拉伯糖组成，红外光谱显示有典型的多糖吸收峰。）；RPMI-1640(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；H2O2(重庆川江化学试剂厂)；丙二醛(MDA)，SOD，LDH试剂盒（南京建成生物工程研究所）；噻唑蓝（MTT，Amerisco，北京拜尔迪生物公司分装）；I型胶原试剂盒（美国BPB公

9、司）。1.3 仪器 CO2恒温培养箱（美国Thermo Forma，Model 311）；TDL80-2B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；XD-101倒置显微镜（南京江南光电集团股份有限公司）；相差倒置显微镜（德国Zeiss）；SZX型超净工作台（上海浦东跃欣科学仪器厂）；722s型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）； 450型酶标仪（美国Bio-Rad）。2  方法2.1  细胞培养及分组将冷冻保存于液氮中的HSC复苏后接种于含10%小牛血清、100 IU/ml青霉素、100 g/ml链霉素，4 mmol/L谷氨酰胺的RMPI1640培养液中，37，5

10、%CO2条件下培养。当细胞呈单层致密状时，0.25%胰蛋白酶消化后传代，24 h换液，72 h再次传代。每次实验均在呈指数生长的细胞中进行。分组：空白组；H2O2组； H2O2+ YLS 25 g/ml组；H2O2+ YLS 50 g/ml组； H2O2+YLS 100 g/ml组； H2O2+ YLS 200 g/ml组； H2O2+VitE 50 mol/L组。每组6孔，H2O2浓度均为3.0 mol/L，VitE为阳性对照4，各组H2O2均于YLS干预前30 min加入。加入药物后继续培养24 h，然后收集细胞观察各项指标。2.2  MTT法测定细胞增殖 将HSC以1

11、×105/ml培养于96孔板，培养48 h，换含药的培养液继续培养24 h，每组6孔，各孔加入20 l MTT试剂，轻轻混匀，继续37培养4 h，吸出全部液体，加200 l DMSO，微量振荡器上振荡15 min，待溶解完全，于酶标仪570 nm波长比色。2.3  细胞毒性实验5LDH比色法检测YLS对HSC-T6的细胞毒性。传一代培养的HSC以5%小牛血清的1640培养液制备为1×105/ml细胞悬液，接种于96孔板，每孔200 l，至细胞长至近单层后，分组后更换含5%小牛血清终浓度不同的YLS的1640培养液，每组6孔。继续培养24 h，收集培养上清，按乳酸脱

12、氢酶(LDH)测试盒说明测定培养上清中的LDH活力。2.4   ELISA法测定上清液I型胶原含量6 将HSC以1×105/ml培养于96孔板，培养48 h换含药的培养液继续培养24 h后，收集培养上清液。取出酶标板，分别加入培养上清和标准品，每组6孔；每孔加入50 l的酶标记溶液；25孵育反应90 min；洗液清洗6次；每孔加入底物A、B液各50 l；25孵育反应15 min；每孔加入50 l终止液，终止反应；于酶标仪450 nm波长比色。2.5  MDA含量和SOD活力测定按试剂盒说明测定。2.6  数据处理 所有数据均以

13、7;s表示，采用t检验进行统计处理。3  结果3.1  YLS对HSC-T6增殖的作用表1显示，与空白对照组比较，模型组HSC的增殖明显升高；与模型对照组比较，YLS各剂量组不同程度降低HSC的增殖，呈明显剂量-效应关系。表1  YLS对HSC增殖的影响（略）3.2  YLS的细胞毒性作用从表2结果发现，与空白对照组相比， YLS各剂量组培养上清液中LDH活力未见显著性差异，表明YLS无细胞毒性。表2  YLS对LDH活力的影响（略）3.3  YLS对HSC I型胶原水平的影响表3结果显示，与对照组比较，模型组型胶原水平明显升高，给予

14、YLS后各剂量组型胶原水平明显降低。表3  YLS对型胶原含量的影响（略）3.4  YLS对培养液中MDA和SOD活力的影响表4显示，与空白对照组比较，模型组MDA水平明显升高，而SOD活力显著降低。给予YLS后，MDA水平明显降低，SOD活力明显升高，且呈明显剂量效应关系。表4  YLS对MDA和SOD活力的影响(略)4  讨论肝纤维化是一切慢性肝病的共同病理学基础，是形成肝硬化的必经病理阶段。近年来，对于肝纤维化发生机理的研究已深入到细胞学、分子生物学水平。大量资料表明，HSC的增殖和活化是肝纤维化发生的细胞学基础，是各种病因致肝纤维化发生的共同中心

15、环节7，8。HSC位于肝脏Disse间隙，正常情况下处于“静止状态”。当肝脏损伤发生炎症后，HSC被激活，并大量增殖。活化的HSC向肌纤维样细胞转化，合成大量的细胞外基质、分泌趋化因子及细胞因子、细胞外基质降解酶合成异常等，最终导致肝纤维化9，10。氧化应激在HSC活化、增殖中起重要作用1114。损伤的肝细胞、活化的Kupffer细胞以及嗜中性粒细胞等炎症细胞均产生H2O2等活性氧（ROS），这些ROS及其脂质过氧化物（LPO）降解产物，可以通过旁分泌机制刺激HSC活化；另外，外源性ROS也可直接刺激HSC增殖。有研究表明，致纤维形成细胞因子TGF-首先诱导HSC产生H2O2，增加的H2O2直

16、接上调型胶原1mRNA表达；另外，以H2O2直接刺激HSC后，型胶原1mRNA表达也明显增加，加入过氧化氢酶则能逆转TGF-引起的型胶原1RNA上调，因此减轻氧化应激，阻止脂质过氧化的发生可以抑制HSC活化、增殖，减少胶原的合成，减轻肝纤维化。既往研究表明，YLS具有抗氧自由基，抑制脂质过氧化的作用。因此本实验选用YLS研究它对氧应激所致HSC纤维化效应的影响。研究结果显示，模型组HSC增殖明显高于空白对照组，其机制可能是脂质过氧化产物直接促进HSC的激活和影响HSC的功能；YLS能明显抑制HSC的增殖，各剂量组还明显降低HSC培养液中型胶原的水平；YLS能明显降低HSC培养液中异常升高MDA

17、的含量，同时提高SOD的活力。MDA是脂质过氧化产物，它的水平间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，而SOD的活力又间接反映机体清除自由基的能力，它们是一对互相影响的指标。本实验结果显示，两者呈负相关关系，其机制可能是氧应激时SOD的活力下降，体内的自由基失平衡，引起MDA大量产生，治疗组可升高SOD的活力，降低了体内的自由基水平，从而降低了MDA的水平。研究结果提示，YLS可能通过抑制脂质过氧化从而抑制HSC的活化、增殖和ECM的生成，起到抗肝纤维化的作用。    【参考文献】  1焦杨，段小群，黄仁彬，等.玉郎伞提取物对超氧阴离子自由基

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