生物化学-第四章酶ppt课件

1、 第第 四四 章章 酶化学酶化学Enzyme)Enzyme)学习目的与要求：学习目的与要求：1. 酶的概念及开展分类及命名酶的概念及开展分类及命名 5.酶作用的机制酶作用的机制2.酶催化作用的特点酶催化作用的特点 6.酶促反响的速度及其影响要素酶促反响的速度及其影响要素3.酶的化学本质及组成酶的化学本质及组成 7.酶的分别纯化与酶活力测定酶的分别纯化与酶活力测定4.酶构造与其生物活性的关系酶构造与其生物活性的关系 8.酶的多样性酶的多样性重点：重点：1.1.酶的化学本质及组成酶的化学本质及组成 4.4.酶促反响的速度及其影响要素酶促反响的速度及其影响要素2.2.酶构造与其生物活性的关系酶构造与

2、其生物活性的关系 5.5.酶的分别纯化与酶活力测定酶的分别纯化与酶活力测定3.3.酶作用的机制酶作用的机制难点：难点：1.酶作用的机制酶作用的机制 3.抑制剂对酶反响的影响抑制剂对酶反响的影响2.底物浓度对酶促反响速度影响底物浓度对酶促反响速度影响 4.酶活力测定酶活力测定第一节、酶的概念，分类及命名第一节、酶的概念，分类及命名一一. .酶的概念及开展酶的概念及开展 酶是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专注酶是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专注性的特殊蛋白质。简单说，酶是一类由活性细胞产生的生性的特殊蛋白质。简单说，酶是一类由活性细胞产生的生物催化剂。物催化剂。酶的概念酶的概念开

3、展史开展史(1)(1)酶是蛋白质酶是蛋白质: : 1926 1926年年,James Summer,James Summer由刀豆制出脲酶结晶确立酶是蛋白质的由刀豆制出脲酶结晶确立酶是蛋白质的观念，其具有蛋白质的一切性质。观念，其具有蛋白质的一切性质。(2)(2)核酶的发现：核酶的发现： 1981 198119821982年，年，Thomas R.CechThomas R.Cech实验发现有催化活性的天然实验发现有催化活性的天然RNARibozymeRNARibozyme。 L19 RNA L19 RNA和核糖核酸酶和核糖核酸酶P P的的RNARNA组分具有酶活性是两个最著名的组分具有酶活性是

4、两个最著名的例子。例子。 2019 2019年，发现年，发现DNADNA的催化活性。的催化活性。(3)(3)抗体酶抗体酶abzymeabzyme： 1986 1986年，年，Richard LerrurRichard Lerrur和和Peter SchaltzPeter Schaltz运用单克隆抗体技运用单克隆抗体技术制备了具有酶活性的抗体术制备了具有酶活性的抗体catalytic antibodycatalytic antibody。CH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH二二. . 酶的分类酶的分类n氧化氧化- -复原酶催化氧化复原酶催化氧化- -复原反响。复原反响。n

5、主要包括脱氢酶主要包括脱氢酶(Dehydrogenase)(Dehydrogenase)和氧化酶和氧化酶(Oxidase)(Oxidase)。n如，乳酸如，乳酸(Lactate)(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反响。脱氢酶催化乳酸的脱氢反响。1.1.氧化氧化- -复原酶复原酶 OxidoreductaseOxidoreductaseCH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO转移酶催化基团转移反响，即将一个底物分子的基团或原子转转移酶催化基团转移反响，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。移到另一个底物的

6、分子上。例如，例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反响。谷丙转氨酶催化的氨基转移反响。2.2.转移酶转移酶 TransferaseTransferaseH2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OHn水解酶催化底物的加水分解反响。水解酶催化底物的加水分解反响。n主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。n例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化的脂的水解反响催化的脂的水解反响3.3.水解酶水解酶 HydrolaseHydrolaseHOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOHn裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或裂合

7、酶催化从底物分子中移去一个基团或 原子构成双键的反原子构成双键的反响及其逆反响。响及其逆反响。n 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。n 例如，例如， 延胡索酸水合酶催化的反响。延胡索酸水合酶催化的反响。4. 裂解酶裂解酶 LyaseOCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOH异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。子的重排过程。例如，例如，6-6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反响。磷酸葡萄糖异构酶催化的反响。5.异构酶异构酶 Isomerasen合成酶，又称为衔接

8、酶，可以催化合成酶，又称为衔接酶，可以催化C-CC-C、C-OC-O、C-N C-N 以及以及C-S C-S 键的键的构成反响。这类反响必需与构成反响。这类反响必需与ATPATP分解反响相互偶联。分解反响相互偶联。n A + B + ATP + H-O-H =A A + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi B + ADP +Pi n例如，丙酮酸羧化酶催化的反响例如，丙酮酸羧化酶催化的反响n 丙酮酸丙酮酸 + CO2 + CO2 草酰乙酸草酰乙酸6.6.合成酶合成酶 Ligase or SynthetaseLigase or Synthetase三三. . 酶的命名酶的

9、命名1 1根据其催化底物来命名；根据其催化底物来命名；2 2根据所催化反响的性质来命名；根据所催化反响的性质来命名；3 3结合上述两个原那么来命名；结合上述两个原那么来命名；4 4有时在这些命名根底上加上酶的来源或其它特点。有时在这些命名根底上加上酶的来源或其它特点。1.1.习惯命名法习惯命名法2.2.国际系统命名法国际系统命名法n系统称号包括底物称号、构型、反响性质系统称号包括底物称号、构型、反响性质,2,2个底物，底物个底物，底物n之间之间“ ：，水解酶水解：，水解酶水解2 2字可省略，最后加一个酶字。字可省略，最后加一个酶字。n例如：例如：( (习惯称号习惯称号: :谷丙转氨酶谷丙转氨酶

10、) )n 系统称号系统称号:L-:L-丙氨酸丙氨酸 ：- -酮戊二酸氨基转移酶酮戊二酸氨基转移酶n 酶催化的反响酶催化的反响: : n 谷氨酸谷氨酸 + + 丙酮酸丙酮酸 - -酮戊二酸酮戊二酸 + + 丙氨酸丙氨酸四四. .酶的编号酶的编号例如：例如： RNaseT1-EC3148 EC - 酶酶 3 - 水解酶水解酶 1 - 脂键脂键 4 - 磷酸二酯键磷酸二酯键 8 - 编号第编号第8个个第二节、 酶催化作用的特点一.酶和普通催化剂的共性及酶催化作用特性1.1.酶和普通催化剂的共性：酶和普通催化剂的共性：n加快反响速度；加快反响速度；n不改动平衡常数；不改动平衡常数；n本身不参与反响。本

11、身不参与反响。2.2.酶催化作用特性：酶催化作用特性：n条件温暖：常温、常压、条件温暖：常温、常压、pH=7pH=7；n高效率：反响速度与不加催化剂相比可提高高效率：反响速度与不加催化剂相比可提高108108 10201020，与加普通催化剂相比可提高，与加普通催化剂相比可提高10710710131013；n专注性：即酶只能对特定的一种或一类底物起作用。专注性：即酶只能对特定的一种或一类底物起作用。n易变敏感性：易受各种要素的影响。易变敏感性：易受各种要素的影响。n酶的活性调理控制：受在活细胞内遭到精细严厉的调理控制。酶的活性调理控制：受在活细胞内遭到精细严厉的调理控制。n酶分子代谢更新：酶分

12、子代谢更新：二二. .专注性专注性1.1.绝对专注性绝对专注性有些酶只作用于一种底物，催化一个反响，有些酶只作用于一种底物，催化一个反响， 而不作用于任何其它物质。而不作用于任何其它物质。2.2.相对专注性相对专注性这类酶对构造相近的一类底物都有作用。这类酶对构造相近的一类底物都有作用。3.3.立体异构专注性立体异构专注性簇基团专注性簇基团专注性键专注性键专注性旋光异构专注性。旋光异构专注性。几何异构专注性几何异构专注性第三节、酶的化学本质及组成第三节、酶的化学本质及组成一一. .酶的化学本质酶的化学本质1.1.由根本组成单位氨基酸由根本组成单位氨基酸2.2.具有蛋白质的性质具有蛋白质的性质-

13、 -两性离解性质等两性离解性质等3.3.具有双缩脲反响具有双缩脲反响二二. .酶的组成酶的组成全酶全酶(holoenzyme= 酶蛋白酶蛋白 + 辅辅因子因子单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。简单蛋白质简单蛋白质双成份酶双成份酶结合蛋白质结合蛋白质酶酶 酶蛋白酶蛋白apoenzyme 辅因子辅因子cofacter) 辅酶辅酶coenzyme) 辅基辅基(prosthetic group)三三. .酶的辅因子酶的辅因子酶的辅因子是酶的对热稳定的非蛋白小分子物质部分，酶的辅因子是酶的对热稳定的非蛋白小分子物质部分，其主要作用是作为电子、原子

14、或某些基团的载体参与反其主要作用是作为电子、原子或某些基团的载体参与反响并促进整个催化过程。响并促进整个催化过程。(1)(1)传送电子体：如传送电子体：如 卟啉铁、铁硫簇；卟啉铁、铁硫簇；(2)(2)传送氢递氢体：如传送氢递氢体：如 FMN/FADFMN/FAD、NAD/NADPNAD/NADP、C0QC0Q、硫辛酸；、硫辛酸；(3)(3)传送酰基体：如传送酰基体：如 C0AC0A、TPPTPP、硫辛酸；、硫辛酸；(4)(4)传送一碳基团：如传送一碳基团：如 四氢叶酸；四氢叶酸；(5)(5)传送磷酸基：如传送磷酸基：如 ATPATP，GTPGTP；(6)(6)其它作用：其它作用： 转氨基，如转

15、氨基，如 VB6 VB6 ；传送；传送CO2CO2，如，如 生物素。生物素。第四节第四节 酶分子构造与其生物活性的关系酶分子构造与其生物活性的关系一.酶分子构造根据构造不同酶可分为根据构造不同酶可分为单体酶：只需单一的三级构造蛋白质构成。单体酶：只需单一的三级构造蛋白质构成。寡聚酶：由多个两个以上具有三级构造的亚基聚合而成。寡聚酶：由多个两个以上具有三级构造的亚基聚合而成。多酶复合体：由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体。多酶复合体：由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体。二二. .活性中心活性中心活性中心：酶分子中直接和底物结合活性中心：酶分子中直接和底物结合并起催化反响的空间局限部位。并起催化反

16、响的空间局限部位。催化部位催化部位(Catalytic site): 酶分子中促使酶分子中促使底物发生化学变化的底物发生化学变化的部位称为催化部位。部位称为催化部位。通常将酶的结合部通常将酶的结合部位和催化部位总称为位和催化部位总称为酶的活性部位或活性酶的活性部位或活性中心。中心。结合部位决议酶的结合部位决议酶的专注性，专注性，催化部位决议酶所催化部位决议酶所催化反响的性质。催化反响的性质。调控部位调控部位(Regulatory site):(Regulatory site):酶分子中存在着一酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从

17、而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制造用抑制造用三三. .必需基团必需基团酶表现催化活性不可短少的基团。酶表现催化活性不可短少的基团。亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。唑基。酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。H2NCHCCH2OHOOHOHH2NCHCCH2OHOSHSHH2NCHCCH2OHONNHNNH

18、H2NCHCCH2OHOCH2COHOH2NCHCCH2OHOCOHOCOOHH2NCHCCH2OHOCH2CH2CH2NH2NH2H2NCHCCH2OHOOHOH第五节、酶作用的机制第五节、酶作用的机制一一. .酶催化作用与反响活化能酶催化作用与反响活化能自自由由能能反响进程反响进程产物产物反响物反响物IIIIIII： 酶催化反响活化能酶催化反响活化能II： 化学催化剂反响活化能化学催化剂反响活化能III：无催化反响活化能：无催化反响活化能二二. .酶催化作用的中间产络合物学说酶催化作用的中间产络合物学说n在酶催化的反响中，第一步是酶与底物构成酶在酶催化的反响中，第一步是酶与底物构成酶底物中

19、间复合物。当底物分子在酶作用下发底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化生化学变化, ,中间复合物再分解成产物和酶。中间复合物再分解成产物和酶。nE + S = E-S E + S = E-S P + E P + En许多实验现实证明了许多实验现实证明了E ES S复合物的存在。复合物的存在。E ES S复合物构成的速率与酶和底物的性质有关。复合物构成的速率与酶和底物的性质有关。三三. . 使酶具有高效性的机制使酶具有高效性的机制1.1.临近定向效应临近定向效应l在酶促反响中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶促反响中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓

20、度大大添加，有利于提高反响速度；在酶活性中心的有效浓度大大添加，有利于提高反响速度；l另一方面，由于活性中心的立体构造和相关基团的诱导和定另一方面，由于活性中心的立体构造和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反响的基团相互接近，并被严厉定向作用，使底物分子中参与反响的基团相互接近，并被严厉定向定位，使酶促反响具有高效率和专注性特点向定位，使酶促反响具有高效率和专注性特点. .2.“2.“张力和张力和“形变形变 底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生子的敏感键产生“张力甚至张力甚至“形变形变 ，从而促使

21、酶底物中间，从而促使酶底物中间产物进入过渡态。产物进入过渡态。3.3.酸碱催化酸碱催化l酸酸- -碱催化可分为狭义的酸碱催化可分为狭义的酸- -碱催化和广义的酸碱催化和广义的酸- -碱催化。酶参碱催化。酶参与的酸与的酸- -碱催化反响普通都是广义的酸碱催化方式。碱催化反响普通都是广义的酸碱催化方式。l广义酸碱催化是指经过质子酸提供部分质子广义酸碱催化是指经过质子酸提供部分质子, ,或是经过质子或是经过质子碱接受部分质子的作用，到达降低反响活化能的过程。碱接受部分质子的作用，到达降低反响活化能的过程。l酶活性部位上的某些基团可以作为良好的质子供体或受体对酶活性部位上的某些基团可以作为良好的质子供

22、体或受体对底物进展酸碱催化。底物进展酸碱催化。His His 残基的咪唑基是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。残基的咪唑基是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。-COOH, -NH3, -SH,+OHNHNH+-COO , -NH2, -S , -.-O-NHN:4.4.共价催化共价催化l催化剂经过与底物构成反响催化剂经过与底物构成反响活性很高的共价过渡产物，使活性很高的共价过渡产物，使反响活化能降低，从而提高反反响活化能降低，从而提高反响速度的过程，称为共价催化。响速度的过程，称为共价催化。l酶中参与共价催化的基团主酶中参与共价催化的基团主要包括要包括 His His 的咪唑基

23、，的咪唑基，Cys Cys 的巯基，的巯基，Asp Asp 的羧基，的羧基，Ser Ser 的羟基等。的羟基等。l某些辅酶，如焦磷酸硫胺素某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。价催化作用。四四. .酶专注性的机制酶专注性的机制以为整个酶分子的天然构象是具有刚性构造的，酶外表具有特以为整个酶分子的天然构象是具有刚性构造的，酶外表具有特定的外形。酶与底物的结合好像一把钥匙对一把锁一样定的外形。酶与底物的结合好像一把钥匙对一把锁一样1.1.锁钥假说锁钥假说(lock and key hypothesis)(lock and key hypothesi

24、s)该学说以为酶外表并没有一种与底物互补的固定外该学说以为酶外表并没有一种与底物互补的固定外形，而只是由于底物的诱导才构成了互补外形形，而只是由于底物的诱导才构成了互补外形. .2.2.诱导契合假说诱导契合假说inducedinducedfit hypothesis)fit hypothesis)第六节、酶促反响动力学第六节、酶促反响动力学一一. .底物浓度对酶促反响速度影响底物浓度对酶促反响速度影响底物浓度对酶促反响速度影响底物浓度对酶促反响速度影响 在酶浓度，在酶浓度，pHpH，温度等条件不，温度等条件不变的情况下研讨底物浓度和反响变的情况下研讨底物浓度和反响速度的关系。如右图所示：速度的

25、关系。如右图所示：在低底物浓度时在低底物浓度时, , 反响速度与底反响速度与底物浓度成正比，表现为一级反响物浓度成正比，表现为一级反响特征。特征。当底物浓度到达一定值时，底物当底物浓度到达一定值时，底物浓度添加，反响速度添加，表现浓度添加，反响速度添加，表现为混合级反响特征为混合级反响特征当底物浓度，几乎一切的酶都与当底物浓度，几乎一切的酶都与底物结合后，反响速度到达最大底物结合后，反响速度到达最大值值VmaxVmax，此时再添加底物浓，此时再添加底物浓度，反响速度不再添加，表现为度，反响速度不再添加，表现为零级反响。零级反响。V=Vmax SKm + S二二.米氏方程米氏方程19131913

26、年，德国化学家年，德国化学家MichaelisMichaelis和和MentenMenten根据中间产物学说对根据中间产物学说对酶促反映的动力学进展研讨，推导出了表示整个反响中底物浓酶促反映的动力学进展研讨，推导出了表示整个反响中底物浓度和反响速度关系的著名公式，称为米氏方程。度和反响速度关系的著名公式，称为米氏方程。Km Km 米氏常数米氏常数Vmax Vmax 最大反响速度最大反响速度三三.米氏方程的推导米氏方程的推导V=V m ax S K m + SKmKm最小的底物最小的底物V= 80% Vmax V= 80% Vmax 时，时， (S)=(S)=？ 由：由： 0.8 Km + 0.

27、2 (S)= (S), 0.8 Km = 0.2 (S)0.8 Km + 0.2 (S)= (S), 0.8 Km = 0.2 (S) (S)=4 Km (S)=4 Km 又又: V= 99% Vmax , (S)= 99 Km: V= 99% Vmax , (S)= 99 Km6.6.了解酶的底物在体内的浓度程度了解酶的底物在体内的浓度程度Km (S)Km (S)7.7.判别反响的方向判别反响的方向KmKm最小的反响最小的反响8.8.判别抑制造用的类型判别抑制造用的类型五五. .米氏常数米氏常数KmKm的测定的测定-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol

28、.L-1)1/v1/Vmax1/Vmax斜率斜率=Km/Vmax=Km/Vmax-1/Km-1/KmV=V m ax S K m + S斜率斜率=-Km=-Km102030405060708090020406080100Tem perature OCRelative Activity (%)最适温度第七节第七节 影响酶促反响速度的要素影响酶促反响速度的要素一一. .温度对酶反响的影响温度对酶反响的影响n一方面是温度升高一方面是温度升高, ,酶促反酶促反响速度加快。响速度加快。n另一方面另一方面, ,温度升高温度升高, ,酶的高酶的高级构造将发生变化或变性，级构造将发生变化或变性，导致酶活性降低

29、甚至丧失。导致酶活性降低甚至丧失。 n因此大多数酶都有一个最适因此大多数酶都有一个最适温度。温度。 在最适温度条件下在最适温度条件下, ,反响速度最大。反响速度最大。二二.pH.pH对酶反响的影响对酶反响的影响n在一定的pH下, 酶具有最大的催化活性,通常称此pH为最适pH。速度酶浓度三三. .酶浓度对酶反响的影响酶浓度对酶反响的影响在底物足够过量而其它条件固定的情况下，并且反响系在底物足够过量而其它条件固定的情况下，并且反响系统中不含有抑制酶活性的物质及其他不利于酶发扬作用统中不含有抑制酶活性的物质及其他不利于酶发扬作用的要素时，酶促反响的速度和酶浓度成正比的要素时，酶促反响的速度和酶浓度成

30、正比四四. .激活剂对酶反响的影响激活剂对酶反响的影响1.1.概念：凡是能提高酶活力的物质概念：凡是能提高酶活力的物质( (简单化合物简单化合物) )都称为酶的激活剂。都称为酶的激活剂。 activator)activator)。2.2.成分：其中大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。成分：其中大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。 如：如：Na+Na+、K+K+、Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+、Cu2+Cu2+、Zn2+Zn2+、Co2+Co2+、Cr2+Cr2+、Fe2+Fe2+、 Cl-Cl-、Br-Br-、I-I-、CN-CN-、NO3-NO3-、PO4- PO4- 、GSH

31、GSH 、VitC VitC 等；等；3.3.功能：功能：1 1. .这些离子可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合，这些离子可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合， 能够是酶活性部位的组成部分，能够是酶活性部位的组成部分， 2 2. .也能够作为辅酶或辅基的一个组成部分起作用；也能够作为辅酶或辅基的一个组成部分起作用；4.4.特点：特点：1 1. .普通情况下，一种激活剂对某种酶是激活剂，而对另普通情况下，一种激活剂对某种酶是激活剂，而对另 一种酶那么不一定是激活剂，能够发生抑制造用；一种酶那么不一定是激活剂，能够发生抑制造用； 2 2. .对于同一种酶，不同激活剂浓度会产生不同的作用。对于同一种酶，不

32、同激活剂浓度会产生不同的作用。 五五. .抑制剂对酶反响的影响抑制剂对酶反响的影响一一. .酶的抑制造用的概念酶的抑制造用的概念有些物质能与酶分子上某些必需基团结合作用有些物质能与酶分子上某些必需基团结合作用),使酶的活使酶的活性中心的化学性质发生改动，导致酶活力下降或丧失，这性中心的化学性质发生改动，导致酶活力下降或丧失，这种景象称为酶的抑制造用。种景象称为酶的抑制造用。抑制剂：抑制剂： 可以引起酶的抑制造用的化合物那么称为抑制剂可以引起酶的抑制造用的化合物那么称为抑制剂 inhibitor)。 抑制造用的特点：酶的抑制剂普通具备两个方面的特点：抑制造用的特点：酶的抑制剂普通具备两个方面的特

33、点：a.在化学构造上与被抑制的底物分子或底物的过渡形状类在化学构造上与被抑制的底物分子或底物的过渡形状类似。似。b.可以与酶的活性中心以非共价或共价的方式构成比较稳可以与酶的活性中心以非共价或共价的方式构成比较稳定的复合体或结合物。定的复合体或结合物。二二. .抑制造用的类型抑制造用的类型1.1.不可逆抑制造用不可逆抑制造用抑制剂与酶反响中心的抑制剂与酶反响中心的活性基团以共价方式结活性基团以共价方式结合，引起酶的永久性失合，引起酶的永久性失活。如有机磷毒剂二异活。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。丙基氟磷酸酯。 2.2.可逆抑制造用：可逆抑制造用： 抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时

34、性丧失。抑剂抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑剂可以经过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性可以经过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类：根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类：1竞争性抑制：竞争性抑制：概念：某些抑制剂的化学构造与底物类似，因此能与底物竟争概念：某些抑制剂的化学构造与底物类似，因此能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反响中心之外，其结果是酶促反响被抑制了。在反响中心之外，其结果是酶促反响被抑制了。特点：竟争性

35、抑制通常可以经过增大底物浓度，即提高底物的特点：竟争性抑制通常可以经过增大底物浓度，即提高底物的竞争才干来消除。竞争才干来消除。竞争性抑制可用下式表示：竞争性抑制可用下式表示：竞争性抑制造用的速度方程：竞争性抑制造用的速度方程：竞争性抑制造用的竞争性抑制造用的LineweaverLineweaverBurkBurk图图 ：2非竞争性抑制：非竞争性抑制：概念：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至概念：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为

36、非竞争性抑制剂。以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子如某些金属离子Cu2+、Ag+、Hg2+以及以及EDTA等，通常能与酶等，通常能与酶分子的调控部位中的分子的调控部位中的-SH基团作用，改动酶的空间构象，引起非竞争基团作用，改动酶的空间构象，引起非竞争性抑制。性抑制。特点：非竟争性抑制不能经过增大底物浓度的方法来消除。特点：非竟争性抑制不能经过增大底物浓度的方法来消除。非竞争性抑制可用下式表示：非竞争性抑制可用下式表示：非竞争性抑制造用的速度方程：非竞争性抑制造用的速度方程：非竞争性抑制造用的非竞争性抑制造用的LineweaverLineweaverBurkBurk图图 ：3 3反竞争性抑制

37、：反竞争性抑制：概念：酶只需在与底物结合后，才干与抑制剂结合，概念：酶只需在与底物结合后，才干与抑制剂结合， 引起酶活性下降。引起酶活性下降。反竞争性抑制可用下式表示：反竞争性抑制可用下式表示：特点：非竟争性抑制不能经过增大底物浓度的方法来消除。特点：非竟争性抑制不能经过增大底物浓度的方法来消除。反竞争性抑制造用的速度方程：反竞争性抑制造用的速度方程：反竞争性抑制造用的反竞争性抑制造用的LineweaverLineweaverBurkBurk图图 ：第八节、酶的分别纯化与酶活力测定第八节、酶的分别纯化与酶活力测定一一. .酶的分别纯化酶的分别纯化1.1.根本原那么根本原那么 提取过程中防止酶变

38、性而失去活性提取过程中防止酶变性而失去活性 防止强酸、强碱、高温暖猛烈搅拌等防止强酸、强碱、高温暖猛烈搅拌等 要求在低温下操作要求在低温下操作 参与的化学试剂不使酶变性参与的化学试剂不使酶变性 操作中参与缓冲溶液操作中参与缓冲溶液2.2.根本操作程序根本操作程序u选材：微生物微生物发酵物选材：微生物微生物发酵物: : 胞内酶，胞内酶，胞外酶，动物动物器脏：消化酶，血胞外酶，动物动物器脏：消化酶，血液：液：SODSOD酶，尿液：尿激酶等酶，尿液：尿激酶等, ,植物木植物木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等。瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等。u抽提：参与提取液提取。胞内酶先要进展抽提：参与提取液提取。胞内酶先要进展细胞

39、破碎机械研磨，超声波破碎，反复细胞破碎机械研磨，超声波破碎，反复冻融或自溶等，冻融或自溶等，u分别：先进展净化处置过滤，絮凝，离分别：先进展净化处置过滤，絮凝，离心脱色，再采用沉淀法分别盐析法，心脱色，再采用沉淀法分别盐析法，有机溶剂沉淀法，超离心等。有机溶剂沉淀法，超离心等。u纯化：可采用离子交换层析，凝胶过滤，纯化：可采用离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等方法。液相色谱，亲和色谱和超滤等方法。3.3.酶的制剂方式酶的制剂方式u固体：枯燥冰冻升华，喷雾枯燥，真空枯燥固体：枯燥冰冻升华，喷雾枯燥，真空枯燥u液体：溶液液体：溶液4.4.保管保管低温下短期保管低温下短期保管0-40

40、-4固体固体-20-20-70-70液体液体二二. .酶活力的测定酶活力的测定1.1.酶活力概念酶活力概念酶活力：又称为酶活性，普通把酶催化一定化学反响的才干称酶活力：又称为酶活性，普通把酶催化一定化学反响的才干称为酶活力，通常以在一定条件下酶所催化的化学反响速度来表为酶活力，通常以在一定条件下酶所催化的化学反响速度来表示。酶活力可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的示。酶活力可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的添加量表示，单位为添加量表示，单位为mol/minmol/min等。等。2.2.酶活力的表示方法酶活力的表示方法- -酶活力单位酶活力单位酶活力单位的根本定义为：酶活力单

41、位的根本定义为： 规定条件最适条件下一定时间内催化完成一定化学规定条件最适条件下一定时间内催化完成一定化学反响量所需的酶量。反响量所需的酶量。据不同情况有几种酶活力单位据不同情况有几种酶活力单位activity unitactivity unit或又称酶或又称酶单位单位enzyme unitenzyme unit国际单位国际单位U UUnitUnit：是以最正确条件或某一固定条件下每分钟催化：是以最正确条件或某一固定条件下每分钟催化生成生成1mol1mol产物所需求的酶量为一个酶活力单位。产物所需求的酶量为一个酶活力单位。“KatalKatal单位：是指在一定条件下单位：是指在一定条件下1 1

42、秒钟内转化秒钟内转化1mol1mol底物底物所所需的酶量。需的酶量。KatKat和和U U的换算关系：的换算关系：1 Kat=61 Kat=6107U107U，1U=16.67n Kat1U=16.67n Kat 以上的酶单位定义中，假设底物以上的酶单位定义中，假设底物S S有一个以上可被作有一个以上可被作用的化学键，那么一个酶单位表示用的化学键，那么一个酶单位表示1 1分钟使分钟使1mol1mol有关基团转有关基团转化的酶量。化的酶量。 假设是两个一样的分子参与反响，那么每分钟催化假设是两个一样的分子参与反响，那么每分钟催化2mol2mol底物转化的酶量称为一个酶单位。底物转化的酶量称为一个

43、酶单位。 在在“U U和和“katkat酶活力单位的定义和运用中，酶催化底物的分酶活力单位的定义和运用中，酶催化底物的分子量必需是知的，否那么将无法计算。子量必需是知的，否那么将无法计算。习惯单位习惯单位在实践运用中，不同酶有各自的规定，如：在实践运用中，不同酶有各自的规定，如：-淀粉酶活力单位：每小时分解淀粉酶活力单位：每小时分解1g1g可溶性淀粉的酶量为可溶性淀粉的酶量为一个酶单位。一个酶单位。QB546-80QB546-80，也有规定每小时分解，也有规定每小时分解1mL2%1mL2%可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一个酶单位。显然可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一个酶单位。显然后者比前一

44、个单位小。后者比前一个单位小。糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶性糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生淀粉产生1mg1mg复原糖以葡萄糖计所需的酶量为一个酶复原糖以葡萄糖计所需的酶量为一个酶单位。单位。蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1g1g酪氨酸所需的酶量。酪氨酸所需的酶量。DNADNA限制性内切酶：引荐反响条件下，一小时内可完全限制性内切酶：引荐反响条件下，一小时内可完全消化消化1g1g纯化的纯化的DNADNA所需的酶量。所需的酶量。比活力比活力: :指每指每mgmg酶蛋白质酶蛋白质/ /蛋白氮所含的酶活力

45、单位数。蛋白氮所含的酶活力单位数。比活力比活力=U=U或或Kat/mgKat/mg酶蛋白或蛋白氮酶蛋白或蛋白氮(U(U或或Kat/mlKat/ml酶液酶液, ,或或U U或或Kat/mgKat/mg酶制剂酶制剂比活力表示酶制剂的纯度的一个目的。比活力表示酶制剂的纯度的一个目的。4.4.酶活力中心转换数酶活力中心转换数5.5.酶活力测定酶活力测定酶活力测定就是测定一定量的酶，在单位时间内产物酶活力测定就是测定一定量的酶，在单位时间内产物(P)(P)的生成添加量或底物的生成添加量或底物S S的耗费减少量。的耗费减少量。即测定时确定三种量：即测定时确定三种量：参与一定量的酶；一定时间间隔；物质的增减

46、量。参与一定量的酶；一定时间间隔；物质的增减量。1 1. .测定酶活力常有以下几种方法测定酶活力常有以下几种方法u反响计时法：反响计时必需准确。反响体系必需预热至规定温度后，反响计时法：反响计时必需准确。反响体系必需预热至规定温度后，u参与酶液并立刻计时。反响到时，要立刻灭酶活性，终止反响，并参与酶液并立刻计时。反响到时，要立刻灭酶活性，终止反响，并记录终了时间。终止酶反响。记录终了时间。终止酶反响。u常使酶立刻变性最常用的方法：常使酶立刻变性最常用的方法：u是参与三氯乙酸或过氯酸使酶蛋白沉淀。是参与三氯乙酸或过氯酸使酶蛋白沉淀。u也可用也可用SDS使酶变性，或迅速加热使酶变性。使酶变性，或迅

47、速加热使酶变性。u有些酶可用非变性法来停顿反响或用破坏其辅因子来停顿反响有些酶可用非变性法来停顿反响或用破坏其辅因子来停顿反响 。反响量的测定法：测底物减少量或产物生成量均可。在反响过程反响量的测定法：测底物减少量或产物生成量均可。在反响过程中产物是从无到有，变化量明显，极利于测定，所以大都测定产中产物是从无到有，变化量明显，极利于测定，所以大都测定产物的生成量物的生成量2).2).酶活力测定的分析方法酶活力测定的分析方法详细物质量的测定，据被测定物质的物理化学性质经过定量分详细物质量的测定，据被测定物质的物理化学性质经过定量分析法测定。析法测定。常用的方法有：常用的方法有：光谱分析法：酶将产

48、物转变为直接或间接一个可用分光光度法光谱分析法：酶将产物转变为直接或间接一个可用分光光度法或荧光光度法测出的化合物。或荧光光度法测出的化合物。化学法：利用化学反响使产物变成一个可用某种物理方法测出的化化学法：利用化学反响使产物变成一个可用某种物理方法测出的化合物，然后再反过来算出酶的活性。合物，然后再反过来算出酶的活性。 放射性化学法：用同位素标志的底物，经酶作用后生成含放射性的放射性化学法：用同位素标志的底物，经酶作用后生成含放射性的产物，在一定时间内，生成的放射性产物量与酶活性成正比。产物，在一定时间内，生成的放射性产物量与酶活性成正比。 由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体。由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体。催化同一化学反响，构造与性质不同的一类酶催化同一化学反响，构造与性质不同的一类酶如：人乳酸脱氢酶如：人乳酸脱氢酶LDH1 H4 73 2 43 14 10 0 43 12 27.1LDH1 H4 73 2 43 14 10 0 43 12 27.1LDH2 H3M 24 4 44 34 25 0 44 49 34.7LDH2 H3M 24 4 44 34 25 0 44 49 34.7LDH3