生物工程下游技术32微生物细胞破碎2009

1、微生物细胞破碎微生物细胞破碎酶酶来源来源应用范围应用范围L-天冬酰氨酶天冬酰氨酶Eruinia CaratovoraEscherichia Coli治疗急性淋巴癌治疗急性淋巴癌过氧化氢酶过氧化氢酶Aspergillus niger牛奶灭菌后牛奶灭菌后H2O2的清除的清除胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶Nocardia hodochrous胆固醇浆液分析胆固醇浆液分析-半乳糖苷酶半乳糖苷酶Kluyveromyces fragilisSaccharomyces lactis在牛奶在牛奶/乳清中乳糖的水解乳清中乳糖的水解作用作用葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶Aspergillus nigerPenicilluim

2、 notatum葡萄糖浆液分析葡萄糖浆液分析食品中氧的清除食品中氧的清除葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶Yeast临床分析临床分析蔗糖酶蔗糖酶Saccharomyces Cerevisiae糖果、蜜饯糖果、蜜饯青霉素酰化酶青霉素酰化酶Escherichia Coli苄青霉素的脱酰作用苄青霉素的脱酰作用表表1 胞内酶举例胞内酶举例细胞破碎的必要性细胞破碎的必要性药物名药物名宿主宿主用途用途胰岛素胰岛素大肠杆菌大肠杆菌治疗糖尿病治疗糖尿病人生长激素（人生长激素（HGH）大肠杆菌大肠杆菌治疗侏儒病治疗侏儒病-干扰素干扰素大肠杆菌大肠杆菌治疗毛状细胞白血病治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤和卡波济肉

3、瘤表表2 几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物细胞壁的组成与结构细胞壁的组成与结构微生物微生物革兰氏阳性革兰氏阳性细菌细菌革兰氏阴性革兰氏阴性细菌细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚/nm20801013100300100250层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要组成主要组成肽聚糖（肽聚糖（4090）、）、多糖、胞壁多糖、胞壁酸、蛋白质、酸、蛋白质、脂多糖（脂多糖（14）肽聚糖（肽聚糖（510）脂蛋白、脂脂蛋白、脂多糖（多糖（1122）磷脂、蛋白磷脂、蛋白质质葡聚糖（葡聚糖（3040）甘露聚糖甘露聚糖（30）、）、蛋白质（蛋白质（68）、）、脂类（脂类（8.51

4、3.5）多聚糖（多聚糖（8090）脂）脂类、蛋白质类、蛋白质 图图1 革兰氏菌细胞壁结构图革兰氏菌细胞壁结构图 （a）革兰氏阳性菌）革兰氏阳性菌 （b）革兰氏阴性菌）革兰氏阴性菌 图图2 酵母细胞壁的结构示意图酵母细胞壁的结构示意图M甘露聚糖；甘露聚糖； P磷酸二酯键；磷酸二酯键； G葡聚糖葡聚糖 微生物细胞壁的形状、强度取决于细胞壁微生物细胞壁的形状、强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互关联的程度。的组成以及它们之间相互关联的程度。 内因：连接细胞壁网状结构的共价键。内因：连接细胞壁网状结构的共价键。 外因：各类微生物的遗传信息、培养条外因：各类微生物的遗传信息、培养条件、菌龄、外界环境等

5、。件、菌龄、外界环境等。破碎程度的评价破碎程度的评价 破碎程度常用细胞破碎率（破碎程度常用细胞破碎率（%）表示。）表示。 破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：数量的百分比数，即： Y（%）=（N0-N）/N0*100 其中其中N0原始细胞数量；原始细胞数量； N 经经t时间操作后保留下来的未损时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量。害完整细胞数量。N0和和N的确定方法：的确定方法： 直接计数法：通过平板计数技术或血球细直接计数法：通过平板计数技术或血球细胞器上用显微镜观察，直接对适当稀释后胞器上用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行

6、计数。的样品进行计数。 间接计数法：在细胞破碎后，测定悬浮液间接计数法：在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（中细胞释放出来的化合物的量（eg.可溶性可溶性蛋白、酶等）。蛋白、酶等）。细胞破碎技术细胞破碎技术其他新的细胞破碎方法：其他新的细胞破碎方法： 激光破碎法激光破碎法 冷冻冷冻-喷射法喷射法 高速相向流撞击法高速相向流撞击法细胞细胞声波声波搅拌搅拌液压液压冷冻压力冷冻压力动物细胞动物细胞7777革兰氏阴性芽孢杆菌和球菌革兰氏阴性芽孢杆菌和球菌6566革兰氏阳性芽孢杆菌革兰氏阳性芽孢杆菌5(4)54酵母酵母3.5342.5革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌3.5(2)32.5孢子孢

7、子2(1)21菌丝菌丝16(1)5表表3 细胞对破碎的敏感度细胞对破碎的敏感度注：上述数字表示相对敏感度，括号则表示数字不确切。注：上述数字表示相对敏感度，括号则表示数字不确切。常用的破壁方法常用的破壁方法机机械械法法常用的破壁方法常用的破壁方法珠磨法珠磨法作用机理：固体剪切作用作用机理：固体剪切作用图图3 水平搅拌式珠麿机结构示意图水平搅拌式珠麿机结构示意图1细胞悬浮液细胞悬浮液 2细胞匀浆液细胞匀浆液 3珠液分离器珠液分离器 4冷却液出口冷却液出口 5搅拌电机搅拌电机 6冷却液进口冷却液进口 7搅拌桨搅拌桨 8玻璃珠玻璃珠 破碎作用遵循一级动力学定律：破碎作用遵循一级动力学定律： 破碎的速

8、率和效率是所有操作参数的函数，破碎的速率和效率是所有操作参数的函数，如：如：珠体的大小珠体的大小、珠体的装量、细胞浓度、珠体的装量、细胞浓度、操作温度、料液性质、搅拌器转速与构型等。操作温度、料液性质、搅拌器转速与构型等。 此外，与搅拌器的设计和研磨腔的结构此外，与搅拌器的设计和研磨腔的结构也有关系，如转盘外缘速度等。也有关系，如转盘外缘速度等。 一般来说，磨珠越小，细胞破碎速度越快，一般来说，磨珠越小，细胞破碎速度越快，但太小易于漂浮，并难以保留在研磨机的腔体但太小易于漂浮，并难以保留在研磨机的腔体中。通常实验室规模，珠体直径为中。通常实验室规模，珠体直径为0.2mm0.2mm较好，较好，工

9、业规模不得小于工业规模不得小于0.4mm0.4mm。 不同的细胞类别及所需提取的酶在细胞中不同的细胞类别及所需提取的酶在细胞中的位置等也是应考虑的因素。的位置等也是应考虑的因素。 有研究表明，减小磨珠直径起先会提高有研究表明，减小磨珠直径起先会提高卡乐酵母蛋白质的释放速度，但磨珠再小卡乐酵母蛋白质的释放速度，但磨珠再小一些，蛋白质的释放速度反而稍有下降。一些，蛋白质的释放速度反而稍有下降。 eg.eg.从酵母细胞中提取从酵母细胞中提取D-D-葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸脱氢酶，最好使用脱氢酶，最好使用0.55-0.85mm0.55-0.85mm大小的玻璃大小的玻璃珠，而在提取珠，而在提取-D

10、-D-葡萄糖苷酶时，则最好葡萄糖苷酶时，则最好使用较大尺寸（如使用较大尺寸（如1mm1mm直径）磨珠。直径）磨珠。 在一定范围内，增加珠体装填量可以提高在一定范围内，增加珠体装填量可以提高细胞破碎率。但超过某一限度时，反不利于细细胞破碎率。但超过某一限度时，反不利于细胞破碎和蛋白质的释放。胞破碎和蛋白质的释放。 为消除这种影响，必须提高搅拌器的功率，为消除这种影响，必须提高搅拌器的功率，这样又会增大释放的热量，给破碎带来困难。这样又会增大释放的热量，给破碎带来困难。 一般研磨机腔体内的填充密度控制在一般研磨机腔体内的填充密度控制在80%-80%-90%90%，并随珠体大小变化。，并随珠体大小变

11、化。 细胞浓度对悬浮液的流变特性具有影响，细胞浓度对悬浮液的流变特性具有影响，最佳的细胞浓度应用实验来确定。一般用最佳的细胞浓度应用实验来确定。一般用Netzsch LM20Netzsch LM20研磨机破碎时，细胞浓度控制研磨机破碎时，细胞浓度控制在在40%40%左右。左右。 Currie Currie等人的研究表明，操作温度控制在等人的研究表明，操作温度控制在5-405-400 0C C范围内对破碎物的影响较小。范围内对破碎物的影响较小。 常采用冷却夹套和搅拌轴的方式来调节磨常采用冷却夹套和搅拌轴的方式来调节磨室的温度。室的温度。作用机理：液体剪切作用作用机理：液体剪切作用常用的破壁方法常

12、用的破壁方法高压匀浆高压匀浆图图5 高压匀浆机装置图高压匀浆机装置图 此方法中影响破碎的主要因素是压力、此方法中影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器的次数。温度和通过匀浆器的次数。 有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在450-750kg/m450-750kg/m3 3时，温度由时，温度由50500 0C C提高到提高到30300 0C C，破，破碎率约提高碎率约提高1.51.5倍。倍。 图图7细胞浓度及压力大小对破碎率的影响细胞浓度及压力大小对破碎率的影响 匀浆次数匀浆次数图图8 匀浆次数对破碎效果的影响匀浆次数对破碎效果的影响 常用的破壁方法常用的破壁方法超

13、声波破碎超声波破碎作用机理：空化现象作用机理：空化现象 由无数细小的空化气泡破裂而产生的冲由无数细小的空化气泡破裂而产生的冲击波的现象。击波的现象。 超声波振动在液体中传播的音波压强超声波振动在液体中传播的音波压强达到达到1atm1atm时，功率密度为时，功率密度为0.35 w/cm0.35 w/cm2 2，这时，这时超声波的音波压强峰值可达真空或负压，超声波的音波压强峰值可达真空或负压，但实际上无负压存在，因此在液体中产生但实际上无负压存在，因此在液体中产生一个很大的力，将液体分子拉裂成空洞一一个很大的力，将液体分子拉裂成空洞一空化核。此空洞非常接近真空，在超声波空化核。此空洞非常接近真空，

14、在超声波压强反向达到最大时破裂。压强反向达到最大时破裂。 图图10 USB600型微电脑控制超声波细胞粉碎机型微电脑控制超声波细胞粉碎机图图9 超声波细胞破碎仪的结构示意图超声波细胞破碎仪的结构示意图 振幅振幅 细胞悬浮液的黏度细胞悬浮液的黏度 表面张力表面张力 被处理悬浮液的体积被处理悬浮液的体积 珠粒的体积和直径珠粒的体积和直径 探头的形状和材料探头的形状和材料 细胞悬浮液的流速细胞悬浮液的流速影响参数影响参数 常用酶：常用酶： 溶菌酶、溶菌酶、-1,3-1,3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、 -1,6-1,6-葡聚葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶

15、、壳多糖酶等。切酶、壳多糖酶等。 常用的破壁方法常用的破壁方法酶溶法酶溶法 作用机理：作用机理： 利用酶分解细胞壁上特殊的化学键。利用酶分解细胞壁上特殊的化学键。eg. eg. 蜗牛酶蜗牛酶从蜗牛的嗦囊和消化道中从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，含有纤维素酶、果胶酶、制备的混合酶，含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等淀粉酶、蛋白酶等2020多种。多种。 在某些情况下，不加外源酶也可使某些微在某些情况下，不加外源酶也可使某些微生物发生生物发生自溶自溶。 eg.eg.谷氨酸生产菌（如乳糖发酵短杆菌）谷氨酸生产菌（如乳糖发酵短杆菌） 加入加入pH10pH10的缓冲液（的缓冲液（0.028mol/

16、LNa0.028mol/LNa2 2COCO3 3 0.018mol/LNaHCO 0.018mol/LNaHCO3 3 ），配），配3%3%的细胞悬浮液，加热至的细胞悬浮液，加热至70700 0C C，保温搅拌，保温搅拌20min20min，菌体即自溶。，菌体即自溶。 所用的化学试剂：酸、碱、表面活性剂、脂溶所用的化学试剂：酸、碱、表面活性剂、脂溶性有机溶剂、性有机溶剂、EDTAEDTA鳌合剂、变性剂等。鳌合剂、变性剂等。常用的破壁方法常用的破壁方法化学渗透法化学渗透法 作用机理：作用机理：改变细胞壁或膜的通透性，从改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来。而使内含物有选择性地

17、渗透出来。 酸、碱：用来调节溶液的酸、碱：用来调节溶液的pH值，改变细胞所值，改变细胞所处环境，改变蛋白质的电荷性。处环境，改变蛋白质的电荷性。 有机溶剂：常用的是甲苯，被细胞壁脂质层有机溶剂：常用的是甲苯，被细胞壁脂质层吸收后导致胞壁膨胀，造成细胞壁破裂。此吸收后导致胞壁膨胀，造成细胞壁破裂。此外，丁醇、丙酮、氯仿等也常用到。外，丁醇、丙酮、氯仿等也常用到。 表面活性剂：天然的如胆酸盐、磷酯，合成的表面活性剂：天然的如胆酸盐、磷酯，合成的如如SDS、Tween、TritonX-100等。等。 变性剂：如盐酸胍，与水中氢键作用，消弱溶变性剂：如盐酸胍，与水中氢键作用，消弱溶质分子间的疏水作用。

18、质分子间的疏水作用。 eg.1. eg.1. 某些动物细胞（肿瘤细胞）可采用某些动物细胞（肿瘤细胞）可采用SDSSDS、去氧胆酸钠等破坏细胞膜；而细胞壁较、去氧胆酸钠等破坏细胞膜；而细胞壁较厚，采用溶菌酶处理效果较好。厚，采用溶菌酶处理效果较好。 2. 2. 用用TritonTriton从一种诺卡氏菌中选择性从一种诺卡氏菌中选择性地提取胆固醇氧化酶。地提取胆固醇氧化酶。l 温和化学渗透剂温和化学渗透剂 p温和化学渗透剂一般是采用甘氨酸、丙氨酸温和化学渗透剂一般是采用甘氨酸、丙氨酸等分子量较小的非极性基氨基酸。等分子量较小的非极性基氨基酸。p其破碎机理可能是因为小分子的甘氨酸、丙其破碎机理可能是

19、因为小分子的甘氨酸、丙氨酸更易渗透到细胞壁中氨酸更易渗透到细胞壁中, ,通过氢键、范德华通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结引力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结构构, ,从而改变细胞壁和细胞膜的通透性。从而改变细胞壁和细胞膜的通透性。 细胞类别细胞类别变性剂变性剂清洁剂清洁剂有机溶有机溶剂剂酶酶抗抗 生素生素生物试剂生物试剂鳌和剂鳌和剂革兰氏阴革兰氏阴性菌性菌*革兰氏阴革兰氏阴性菌性菌*酵母菌酵母菌*植物细胞植物细胞*巨噬细胞巨噬细胞*表表4 不同细胞可采用的化学渗透处理方式不同细胞可采用的化学渗透处理方式表示适用表表5 机械破碎法与非机械破碎法的比较机械破碎法与非机械破碎