单克隆抗体的制备方法

1、一、单克隆抗体的概念和原理免疫反应是人类对疾病具有抵 抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体 的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多 抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的 混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动 物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外，要把这些不 同的抗体分开也极困难。近年，单克隆抗体技术的出现，是 免疫学领域的重大突破。（1）单克隆抗体的基本概念抗体主要由 B 淋巴细胞合成。每个 B 淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上 百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的 B淋巴细胞 合成不同的抗体。当机体受抗原刺

2、激时，抗原分子上的许多 决定簇分别激活各个具有不同基因的B 细胞。被激活的 B 细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一 个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经 分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种 决定簇的抗体，称为单克隆抗体。（2）单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆 B 淋巴 1 细胞，但这种 B 淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓 瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞 与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。 这种杂种细胞继

3、承两种亲代细胞的特性，它既具有B 淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖 永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群， 可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。其制备原理示 意如下：二、基本方法 21. 抗原提纯与动物免疫7 对抗原的要求是纯度越高越好， 尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原，可取1 X 10个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化 的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动 物免疫。选择与所用骨髓瘤细胞同源的 BALB/c健康小鼠，鼠龄在812 周，雌雄不限。 为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死

4、亡， 可同时免疫 34只小鼠。免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗 原形式、 免疫途径不同而异， 以获得高效价抗体为最终目的。 免疫间隔一般23周。一般被免疫动物的血清抗体效价越 高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单 克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中 小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后 34 天，分离脾细胞融合。2. 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备选择瘤细胞株的最重要 的一点是与待融合的 B 细胞同源。如待融合的是脾细胞，各 种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是 SP2/0 细胞株。 该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不

5、分泌 任何5。融合细胞应选择15h10/ml X免疫球蛋白重链或轻链。 细胞的最高生长刻度为 91 0，倍增时间通常为 3 处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于 95）。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含 8- 氮鸟 5，次日一般 即为对 10/ml 嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一 天用新鲜培养基调细胞浓度为 2X 数生长期细胞。 在体外培 养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养 融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞 （feeder cell ）。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备 方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后 的液体中即含

6、小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。 在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所 获细胞会有严重污染。饲养细胞调至1X 5 /mlio，提前一天或当天置板孔中培养。 细胞融合 3. 细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞 混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后用培养液稀释PEG消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔 中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。细胞比例： 骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从 1:2 到 1:1o 不等，常用 1:4 的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。反应 时间：在

7、两种细胞的混合细胞悬液中，第 1min 滴加 4.5ml 4 培养液；间隔 2min 滴加 5ml 培养液，尔后加培养液 5oml。 培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其 中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合 效率降低，应随时核查培养基情况。4.有限稀释法筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。融 合细胞呈克隆生长，经有限稀释后（一般稀释至 o.8 个细胞 /孔），按 Poisson 法计算，应有 36的孔为 1 个细胞 /孔。 细胞培养至覆盖 0%20%孔底时，吸取培养上清用 ELISA 检测抗体含量。首先依抗体

8、的分泌情况筛选出高抗体分泌孔， 将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的 ELISA 测定， 选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。单克隆抗体的制备和冻存 5.筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随 培养时间延长，发生污染、染色体丢失和细胞死亡的机率增 加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细 胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊 的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的 浓缩和纯化。 最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。 选用 BALB/c 小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注 5 射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接

9、种 一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集 510ml的腹 水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫 升可达数毫克甚至数十毫克水平。5鼠，可根据腹 10/ 此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。接种细胞的数量 应适当，一般为5X水生长情况适当增减。 选出的阳性细胞 株应及早冻存。冻存的温度越低越好，冻存于液氮的细胞株 活性仅有轻微的降低，而冻存在- 70 C冰箱则活性改变较快。 细胞不同于菌种， 冻存过程中需格外小心。 二甲基亚砜 （DMSO） 是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在 50 95之间。 如果低于 50，则说明冻存复苏过程有问 题。6. 单克隆抗

10、体的纯化 单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗 体的纯化，腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体 高，纯化效果好。 按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。 一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目 的，也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗 体纯化方法为亲和纯化法，多用葡萄球菌A 蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体(最常用 Sepharose )交联，制备亲和层析 柱将抗体结合后洗脱， 回收率可达 90以上。蛋白可与 IgG1 、 lgG2a、lgG2b和lgG3结合，同时还结合少量的IgM。洗脱液中的 6抗体浓度可用紫外光吸收法粗测，小鼠 lgG 单克隆抗体溶液 在A280nm

11、时，1.44 (吸光单位)相当于 1mg/ml。经低pH洗 脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体 的活性至关重要。三、操作流程(一)脾细胞1 材料(1) 免疫过的血清抗体滴度高的 BALB/c 小鼠(2) 1640 培养液(3) 2.5 FCS 1 640 营养液2操作方法(1) 拉颈或用C02处死小白鼠。(2) 将小鼠放于 70酒精中浸泡消毒， 取出固定于板上， 在 无菌条件下取脾。(3) 把脾放入5ml含有2.5 % FCS的1640液中，冰浴下轻轻 洗去脾上的红血球。7(4) 用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液 移入小试管中。(5) 直立小试管3min，使大块

12、的结缔组织下沉，把细胞悬液 移入离心管中。以 2.5 %FCS1640 充满离心管，并以 400g 离心7min10min (与此同时应开始制备骨髓瘤细胞) 。的新鲜培养液再悬浮。 (7) 把沉淀用约 10ml 重复、 步骤。 (9) 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于 80%为合格。(二)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球 蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的 滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细 胞。选择骨髓瘤细胞的条件：该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生

13、Y球蛋白或不分泌 到细胞外； 6 个细胞最好骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细 胞密度 ,10/ml ； 8 生长速度快，繁殖时间短。目前常用的BALB/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：S194/5XXOBU1;SP2/0Ag14（简称 SP20）;P2 X? Ag8 6 5 3 （简称 653）； F0以 653 最为常用，它是由矿物油 4甲基 15 烷（ Pristane ， 降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（ MinerolOil plasmacytoma， MOPC并经过培育形成一株 8-氮鸟嘌呤 有抵抗力的亚系。骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于 -195 C液氮罐 中，试验时复苏、增殖

14、、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰 酶处理。为了防止出现返祖现象， 在融合前， 77）的骨髓 20h15hx 10对数生长期（即培养6115可将培养基内加入卩g/ml 8 氮鸟嘌呤。取约X 101640液再悬浮并计数。一，沉淀 以瘤细胞，在室温离心（ 400g） 10min2.5 FCS （三）饲养 细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生 存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入 的细胞称之为饲养细胞（ Feeder cell ）。在细胞融合和单克 隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生 长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使

15、用饲养细胞。许多 种类的动物细胞都 9可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细 胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一 方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞 的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细 胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如 C57 鼠，昆明小白 鼠等。1材料（1）小鼠（ BALB/c 或 C57 小白鼠）若干只。（2）11.6 蔗糖溶液（经 10 磅 30min 高压灭菌）。2操作方法（1）拉颈处死小鼠。（2）70酒精浸泡消毒 10min 。（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口

16、，剥开皮肤，露出腹 腔。（4）用注射器将 4ml 11.6 蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻 揉 1min 仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。10（5）1 000r min 离心 10min 。（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝 染色计数活细胞，使每毫升含 40 万个活细胞。（ 7）以 1ml 吸管将细胞种入微量培养皿，每孔 0.05ml ，含2万个细胞，放入 C02培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些（四）融合细胞融合剂 1.细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合 法和生物融合法，如仙台

17、病毒，此处例举化学融合法中的一 种即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG,在分子量为200700时，呈无色、无臭 的粘稠状液体，分子量大于 1 000 时，呈乳白色蜡状固体， 能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化 学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子 量为 4 000 者，常用浓度为 50， pH8.0pH8.2 （用 10 NaHC酮整），3分子量小的PEG融合效应差，又有毒性，分 子量过大，则粘性太大，不易操作。50%浓度，pH偏碱时融合效应最高。11也有采用30%50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜。不同批号的PEG即使分子量相同，但融合率却有明显差异， 选用

18、时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。 要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。2. 融合过程融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。 融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为 1:1 至 10:1 不等。 3:1 或 5:1 最为常用。试剂与材料 1> 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。 (1)。(2) 1640 培养液 100ml 100ml 液。(3) 完全 1640 。液 164050ml (4) 2.5FCS 。培养液 100ml(5) HAT 瓶中高压 灭菌，使用前用预 25mlPEG10gServa000:取分子量 50PEG4 , 高纯度的(日本进口或)放入 12热于4

19、0C的1640液10ml等量(W/V)混合，以酚红检查pH, 一般不必调pH。如pH有改变，可用HCI或NaHC酮整。3(7) 10ml 和 50ml 的灭菌沉淀管或瓶。孔塑料培养盘。 40.操作方法2> 准备好脾细胞。87液。1640% FCS-沉淀 管中混合 50ml10 脾细胞和 10 小鼠骨髓瘤细胞， 并加入 50ml 2.5 在 室温400g离心3min，使细胞沉淀。移去上清液。 轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40 C水浴中，使其达融合温度。 加预热至40 C的50 % PEG0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加， 边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求 持续

20、2min 。13 加 1ml1640 液，边加边摇动，持续 1min。重复一次。 加1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5min 。重复一次。(11)力口 1640液15ml。(12)室温，400g离心1min，使细胞沉 淀。(13)去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。 圍 往已于前一日种有饲养细胞的 40孔塑料培养盘中滴加融 合的细胞液，每孔 1 滴(约 0.05ml )。(15) 轻摇后，放入5%CO2饱和湿度的37C温箱中培育。(16) 第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意 轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加 入适量的饲养

21、细胞。(17) 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每 次换液前用倒置显微镜观察，大约在 10 天左右就可观察到 杂交瘤细胞生长出来。 大多数杂交瘤细胞在 1020 天内出现， 但也有在 1 个月左右才能出现的。 14 杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。(18) 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中， 依情况取消 HAT液和完全1640液而代之以10 uS- 1640液 同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体， 以防止产生抗体细胞的变异和丢失。细胞融合的关键 3.1技术上的误差常常导致融合的失败。 例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失

22、败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术四、杂交瘤细胞的保存(一)保存当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后， 必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，15可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产 生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染 以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下：材料 1(1) 细胞：取对数生长期的细胞。(2) 10 二甲基亚砜保护液(二甲基亚砜能损坏滤器，而又 被高压所破坏， 所以不能过滤或高压消毒。 其本身就是毒品， 无菌)：含 10二甲基亚砜、 20灭活胎牛血清， 70

23、 RPMI 1640 液。100卩g/ml1640 % FCS-培养液：含青霉素 100U/ml，链霉 素(3) 20 2ml 安瓶等 (4) 灭菌的 操作方法 2(1) 去掉细 胞培养瓶中的旧的培养液，加入10%FCS-1640 液，使细胞悬浮。7(2) 1 000r/min 离心10min，去上清。细胞沉淀用 10%二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0 x 10细胞/ ml。(3) 取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95%以上。16(4) 用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml1.0ml ,熔封安瓶。(5) 放 4C 2h 。放液氮罐气态部分（-70 C） 15h。（7） 转入液氮部分。二

24、）复苏1.从液氮罐中取出安瓶立即放37 C水浴中速溶。2.无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液，转入组织培养瓶。3.逐滴缓慢加入20% FCS- 1640培养液3.5ml ,这个过程延 续 3min 。C培养。CO%饱和湿度，374. 5培养液。20% FCS1640后弃去培养液上清，加入新鲜的. 54h 6.继续培养，换液，以至形成单层。动物的选择与免疫 171 .动物的选择 纯种 BALB/C 小鼠，较温顺，离窝的活动范 围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能 饲养成活。 目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种 BALB/C小鼠。2.免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成

25、功，获得高质量的 McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的 特性不同而定。1 ）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应 先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏 不完全佐剂。初次免疫 抗原150卩g加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.81ml,0.2ml/点）J 3周后第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或 ip （腹腔 内注射）（ ip 剂量不宜超过 0.5ml ）J 3周后第三次免疫 剂量同一，不加佐剂， ip （57 天后采血测其 效价）J 23周18加强免疫，剂量 50500卩g为宜，ip或iv （静

26、脉内注射） 3天后J取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：将可溶性抗原 颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面 可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基础免疫可 直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的 免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。（ 2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效 果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为 7 10 个细胞。x 1 27 初次免疫 1 x 10/0.5ml ip周后3；27第二次免疫1 x 10/0.5ml ipJ 3周后197 iv x 10/0.5ml ip 或(融合前三天

27、)加强免疫1 J取脾融合细胞融合细胞融合前准备 1)骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一 品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂 1 ( 。常用的骨 髓瘤细胞系见表 2-4McAb 交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大 量 2-4 用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系表 Ig 链 名称来源耐受药物H LP3/X63-Ag8(X63) BALB/C骨髓瘤 MOPC-218-氮鸟嘌呤 r1 K20 P3/X63-Ag8 P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653) 8- 氮鸟 嘌呤 8- 氮鸟嘌呤 P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)P3/X63-Ag8(不分泌型) K 脾细胞) B

28、ALB/CX63x( P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)8- 氮鸟嘌呤 杂交瘤脾细胞) BALB/CX63x( SP2/0-Ag14(SP2/0) 8- 氮鸟嘌呤 杂交瘤 BALB/C 骨髓瘤 8-氮鸟嘌呤 F0S194/5.XXO.BU.1 P3/X63-Ag8-5-溴脱氧尿嘧啶核苷-MPC11-45.6TG1.7 6-MPC-11 巯鸟嘌呤BALB/C骨髓瘤r2b K21O.RCY3.Ag1.2.38-大鼠骨髓瘤 LOUK - R210氮鸟嘌呤人骨髓瘤Kr1 GM15006TG-A12GM1500巯鸟嘌呤6- 21入& U-266AR 人骨髓瘤 U-266 8-氮鸟嘌 呤，20

29、%、牛血清的浓度一般在 10%如RPMI1640 DMEM培 养基。骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，65431:可按105X /ml为宜，最大浓度不得超过10/ml。当细胞处于对数生长的中期时，10细胞浓度以氮天传代一次。 细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8- 的比例传代。每1: 1035呈均一的敏感性。HAT鸟嘌呤进 行处理，使生存的细胞对）饲养细胞：在组织培养中，单个 或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可 促进这2 （的过程中，许多环节需要加饲养细 McAb些细胞生 长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备胞， 如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培

30、养过程中，加入饲养 细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：经放射线照3T3小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。 也有人用小鼠成纤维细胞系 54细胞/孔。10射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为 2X或10 .细胞融合的步骤2 1） 制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。（10周小 鼠，与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用 BALB/C6 J 22 拉颈处死，浸泡在 75%酒精内， 3 5min用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌注射器注入 56ml 预冷的培养液（严禁刺破肠管）J反复冲洗，吸出冲洗液J6min分离10ml离心管，1200rpm/5冲洗液放入 J 5 /mllOFC

31、S小牛血清（NCS或胎 牛血清（）的培养液混悬，调整细胞数至1X 20%用 J1/10096 加入孔板，孔23放入37 C CO2孵箱培养（2）制备免疫脾细胞 最后一次加强免疫 3 天后小鼠拉颈处死J无菌取脾脏，培养液洗一次J脾脏研碎，过不锈钢筛网J 2离心，细胞用培养液洗次 J计数J 248 脾淋巴细胞悬液备用取 10（3）制备骨髓瘤细胞取对数生长骨髓瘤细胞离心J用无血清培养液洗2次J7细胞备用101 X计数，取得）融合（4 将骨髓瘤细胞 与脾细胞按 1： 10 或 1： 5 的比例混合在一起，在 50ml 离心 管中用无血清不完全培养液洗 1 次，离心， 1200rpm,8min;弃上清，

32、用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。 90s内加入37C预温的1ml45%PEG（分子量4000）溶 液，边加边轻微摇动。37 C水浴作用90s。 加37oC预温的不完全培养液以终止 PEG乍用，每隔2min分别加入 1ml、2ml、3ml、4ml、5ml 和 256mlo 离心， 800rpm, 6min o 充上清，用含20%、牛血清HAT选择培养液重悬。 将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100卩l。一般一个免疫脾脏可接种 4块96孔板。 将培养板置 37C、5%CO培养箱中培养。选择杂交瘤细胞及抗体检测 1 . HAT

33、选择杂交瘤细胞 脾细胞和骨髓瘤细胞经 PEG处理后，形成多种细胞的混合体， 只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄 嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具 有上述两种酶，在 HAT选择培养液可以生长繁殖。在用HAT选择培养12天内，将有大量瘤细胞死亡，34 天后瘤细胞消失，杂交细胞形成、集落， 26HAT选择培养液维持710天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布 满孔底 1/10 面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所 需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每23天

34、换一半培养液。抗体的检测 2 检测抗体的方法应根据抗原的性质、 抗 体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、 特异、敏感的方法为原则。常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性 抗原、细胞 McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA） 可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。杂交瘤的克隆化 杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进 行克隆化。因为经过 HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个 孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多 的克

35、隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要 的抗体（特异性抗体） 分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。 要想将这些细胞彼此分开就需要 27 克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽 早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞 所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞 生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即 使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交 瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。有限稀释法克隆 1 天制备饲养细胞层（同细胞融合） 。 1 （）克隆前 1 2 ）

36、将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹 干，计数。（。个细胞10/ml （3）调整细胞为337C、孵 箱中1001。孵育于。5%CO2（4 ）取头天准备的饲养细胞 层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞天换液，以后每 5）在第 72 31 次。天换液（ 细胞克隆形 成，及时检测抗体活性。天可见） （ 68924 ）将阳性孔的细胞移至（ 7孔板中扩大培养。 28（ 8）每个克隆应尽快冻存。2 .软琼脂培养法克隆（1）软琼脂的配制：含有20%NCS小 牛血清）的 2 倍浓缩的 RPMI1640。C预热。1%琼脂水溶液：高压灭菌，420.5%琼脂：由1 份 1%琼脂加 1 份含 20%小牛血清的 2 倍浓缩

37、的 RPMI1 640配 制而成。置42 C保温。（2）用上述 0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml 倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。3）按 100/ml ， 500/ml 或 5000/ml 等浓度配制需克隆的细 胞悬液。(4) 1ml 0.5%琼脂液(42C预热)在室温中分别与 1ml不 同浓度的细胞悬液相混合。(5 )混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10min，使其凝固，孵育于37C、5%CO孵箱中。(6) 45天 后即可见针尖大小白色克隆，710天后，直接移种至含饲养细胞的 24 孔中进行培养。( 7)检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。29杂交瘤细

38、胞的冻存与复苏1 杂交瘤细胞的冻存 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细 胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞 系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分 泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因 上述意外而前功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含 1 X 106以上，但对原始孔的杂交 瘤细胞可以因培养环境不同而改变， 在 24孔培养板中培养， 当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓿冻存。细胞冻存液： 50%小牛血清； 40%不完全培养液； 10%DMSO (二甲基亚砜) 。冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0C后放入-70 C超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细 胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或