脑微血管内皮细胞的培养及鉴定

1、脑微血管内皮细胞的原代培养脑微血管内皮细胞的原代培养及鉴定及鉴定2007.9- 试验目的及意义：试验目的及意义： 分离并培养脑微血管内皮细胞，建立以脑微血管内皮细胞为主的体外血脑屏障，以进一步研究导致脑部感染性疾病的病原微生物穿透或破坏血脑屏障的致病机制。 试验注意事项试验注意事项 全程严格无菌操作，操作时室内空调16c，消化之前的全部步骤均在冰上进行。操作时间以23小时内为宜。 实验试剂： DMEM、30葡聚糖Dextran、10PBS及PBS（无钙、镁离子）、RPMI1640、肝素heparin、丙酮酸钠、型胶原蛋白Collagen Type1、MEM non-essential amin

2、o acids、胶原蛋白酶Collagenase/Dispase （以上各试剂4保存）、FBS(胎牛血清)、1：1万单位青、链霉素双抗、NuSerum、ECGS 、L-谷氨酰胺、MEM vitamins、DNA酶(DNase)、胰酶（以上各试剂20保存）。 试验器材： 冰盘、圆口瓶、血清瓶、青霉素瓶、烧杯（各种大小）、平皿（各种大小）、眼科剪、眼科镊、匀浆器、15ml和50ml离心管、吸管、滴管、培养瓶、注射器、0.22m针头滤器、漏网、漏勺、200l及1ml枪头、大量冰块（沙）或者冰袋。器材准备器材准备 所有金属、搪瓷器皿必须用洗衣粉水仔细清洗，流水冲洗、烘干后酒精浸泡消毒，之后自然风干，包

3、装高压。 所有玻璃器皿需清洗泡酸、包装后高压。 培养瓶的处理：购买一次性培养瓶，大小为25c。以510g/c为包被浓度，于瓶中加入型胶原蛋白平置摇匀浸没培养面并放于4过夜，次日将液体吸出（可重复利用），置于紫外灯下照1h。4备用。 塑料漏网、血清瓶盖、橡胶瓶盖洗净后均用蒸馏水煮开，并包装高压。器材准备器材准备 玻璃小球高压前用蒸馏水冲洗 玻璃小球柱：将一个10ml的注射器，切去头部，用筛网蒙住切口端，将筛网绑紧，然后以筛网为底，往注射筒中倒入玻璃小球，使之高度大约为1ml，然后高压。在使用之前用1640将玻璃小球湿润，或者，用0.4的过滤纸搭配50ml的试管亦可。 离心机用洗衣粉水清洗，蒸馏水

4、冲洗，并且酒精擦洗消毒。试剂配制试剂配制 双抗：用三蒸水将青霉素、链霉素配成双抗1:10000U，然后过滤分装，20保存。 100L-谷氨酰胺：称量2.923g L-谷氨酰胺，定容于100ml dd H2O，浓度为200mmol/L。0.22针头滤器过虑。20保存。 肝素：用PBS将粉剂肝素溶解为500U/ml，过滤后4保存 组织洗涤液：2FBS，10双抗（如为无菌手术标本则为2），DMEM。4保存。 FBS需先56灭活过滤、分装。20保存。试剂配制试剂配制5.100ml 10PBS(其中不能含有钙以及镁离子)：80ml蒸馏水中溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，

5、0.24g KH2PO4，用NaOH调节pH至7.4加水定容到100mL，取20ml 10PBS，加入180ml去离子水，配成200ml PBS，高压灭菌，室温或4c保存。6.200ml 30葡聚糖：60g溶于200ml去离子水中，高压灭菌(15磅 15分钟，放气后立即取出，防止碳化)。 取200ml葡聚糖，与22ml 10PBS混合。（9:1） 4c保存。试剂配制试剂配制5.消化液：用蒸馏水将胶原蛋白酶和Dnasel分别溶解成100mg/ml。4c保存。试验进行至消化环节时用DMEM将Dnasel和胶原蛋白酶配成终浓度分别为为0.1mg/ml DNasel，1mg/ml胶原蛋白酶的液体 。各

6、种组成混合后0.22过滤灭菌(100mg/ml的DNasel 2ul,胶原蛋白酶20ul加入到2mlDMEM中混匀，0.22um过滤，加入15ml离心管中）。6.培养基（以下各浓度均为终浓度）：RMPI 1640，10FBS，10NuSerum，ECGS 30g/ml，1双抗，肝素5 U/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，1mmol/L丙酮酸钠，MEM non-essential amino acids，MEM vitamins各1。各组分过滤后混合。4c保存。 试验步骤试验步骤1. 取脑：将手术取下的新鲜脑组织置于组织漂洗液中，回实验室后再反复漂洗几次去除血凝块。（8只2-3周的大鼠。）2.

7、取出组织块放于含有小培养皿上（含有少量培养液），培养皿置于冰上。（以后各步骤均于冰上进行）3.3.用镊子小心剥离组织上用镊子小心剥离组织上的软脑膜及肉眼可见的的软脑膜及肉眼可见的小血管，待剥离干净后小血管，待剥离干净后再小心取出再小心取出灰质部分灰质部分即即脑皮质，置于放有漏网脑皮质，置于放有漏网的漏勺上。的漏勺上。试验步骤试验步骤Collection tube4.用研磨棒将组织轻轻研磨，使其从漏网中漏过，分用研磨棒将组织轻轻研磨，使其从漏网中漏过，分散入平皿中（约含有散入平皿中（约含有10ml组织洗涤液）。组织洗涤液）。试验步骤试验步骤5.5.将平皿里的液体转移入匀浆将平皿里的液体转移入匀浆

8、器中，上下推动器中，上下推动10次左右，次左右，直到直到没有肉眼可见没有肉眼可见的大组的大组织块。液体呈现出织块。液体呈现出“奶昔奶昔”状。液体转移入状。液体转移入50ml50ml离心离心管中。管中。试验步骤试验步骤6.在装有组织悬液的离心管中，加入与悬液等体积的葡聚糖PBS混合物。（可见分层）4 8000rpm离心离心15min。试验步骤试验步骤7.吸出上层液体及白色脂质，以12ml PBS小心冲散红色目标沉淀物（即含有微血管的组织），尽量将目标物冲洗尽，然后将PBS组织悬液吸入干净的离心管。试验步骤试验步骤试验步骤试验步骤8.取40-45mlPBS加入离心管中，3000rpm,4c离心5m

9、in。重复2次。其目的是将葡聚糖洗脱。问题：上清液中常可见悬浮小块，经离心后证实其中含有目标组织解决方法：或减少每次PBS用量、3次离心；或加大转速和离心时间；或上清再次离心。Purified Microvessels9.倒出（或吸出）PBS，吸取12ml组织洗涤液将目标沉淀物冲散、吸出，转移至干净的15ml离心管中。 然后取一平皿或烧杯，用组织洗涤液稀释Dnasel和胶原蛋白酶，使之加入离心管后终浓度分别为0.1mg/ml 和1mg/ml。 以注射器吸出，用0.22针头滤器过滤至准备好的离心管中。试验步骤试验步骤10.混匀后放入37摇床中消化，30分钟左右取出一滴至镜下观察，如见到大量细短串状的微血管（3、4个细胞一串），则表示消化适度，30004000rpm 5分钟离心；如为大团状或已成单个细胞，则消化不足或消化过度。试验步骤试验步骤beforeafter试验步骤试验步骤11.离心后弃上清，以PBS 30004000rpm 5分钟 离心，得到的沉淀以23ml细胞培养液冲散、混匀，放入37、5CO2孵箱培养，5个小时左右后再加入12ml培养液。此为原代细胞P1（=parental generation亲代） 之后每日观察细胞状况，贴壁前23日半换液，全部细胞贴壁后视培养液情况每12日全换液一次。细胞铺满瓶底80左右即可考虑传代及冻存。试验记录试验记录 2007年9