第13章-流失细胞术

1、第十三章第十三章 流式细胞术流式细胞术 流式细胞术（流式细胞术（flow cytometry，FCM）是对细胞或细是对细胞或细胞颗粒进行定量分析和细胞分类研究的技术。胞颗粒进行定量分析和细胞分类研究的技术。流式细胞仪又流式细胞仪又称为荧光激活细胞分类器，称为荧光激活细胞分类器，是流体喷射术、激光光学技术、是流体喷射术、激光光学技术、电子计算机技术和显微荧光光度术相结合的高科技产品。应电子计算机技术和显微荧光光度术相结合的高科技产品。应用流式细胞术可对单细胞逐个地进行高速准确的定量分析和用流式细胞术可对单细胞逐个地进行高速准确的定量分析和分类，每秒测定达数千到数万个细胞，且有高度的重复性。分类，

2、每秒测定达数千到数万个细胞，且有高度的重复性。这种高速信息的测量分析和高纯度分类的新技术，为细胞生这种高速信息的测量分析和高纯度分类的新技术，为细胞生物学提供了一种强有力的研究手段。物学提供了一种强有力的研究手段。 第一节第一节 基本原理基本原理 一、流式细胞仪的主要组件一、流式细胞仪的主要组件 1液流系统液流系统 包括包括各种管道、压力调节开关、液体各种管道、压力调节开关、液体流动室和超声振荡器喷嘴。流动室和超声振荡器喷嘴。单个细胞悬液在狭窄的管道单个细胞悬液在狭窄的管道中流动，由于细胞受流体力学的作用，极易形成贴边、中流动，由于细胞受流体力学的作用，极易形成贴边、堆积堆积,从而造成阻塞。为

3、克服此种现象，利用流体聚焦的从而造成阻塞。为克服此种现象，利用流体聚焦的原理，在不同的压力作用下使鞘液（通常用原理，在不同的压力作用下使鞘液（通常用PBS）和细和细胞悬液在喷嘴内形成层流液束，通过细胞测量区。胞悬液在喷嘴内形成层流液束，通过细胞测量区。 2光学系统光学系统 光学系统包括光学系统包括激发光源、各种光学滤片激发光源、各种光学滤片和各种光信号探测器和各种光信号探测器。激光光源通常是采用激光器或汞灯等。激光光源通常是采用激光器或汞灯等。激发光束激发细胞所携带的荧光物质产生荧光，通过光电转激发光束激发细胞所携带的荧光物质产生荧光，通过光电转换器和光电倍增管把微弱的信号变成电的信号，光信号

4、通过换器和光电倍增管把微弱的信号变成电的信号，光信号通过不同的滤片把不同波长的光信号分开，把干扰光滤掉。不同的滤片把不同波长的光信号分开，把干扰光滤掉。 3电子系统电子系统 电子系统包括各种电子系统包括各种放大器、模数转换电放大器、模数转换电路、高压电源和各种分析处理辅助系路、高压电源和各种分析处理辅助系统，还包括把不同细胞统，还包括把不同细胞分离开来的逻辑控制系统。分离开来的逻辑控制系统。 4计算机系统计算机系统 把从细胞获取的数据记录储存起来，把从细胞获取的数据记录储存起来，利用各种不同的软件对数据进行分析加工处理，把结果以图、利用各种不同的软件对数据进行分析加工处理，把结果以图、表的形式

5、输出。表的形式输出。 二、流式细胞仪的工作原理二、流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪要求流式细胞仪要求被检细胞用荧光染料染色，呈悬浮被检细胞用荧光染料染色，呈悬浮状态。状态。经染色的细胞通过样品进入管被压进超声波振荡经染色的细胞通过样品进入管被压进超声波振荡器喷嘴的中央部，同时将无细胞的液体经过另一进入管器喷嘴的中央部，同时将无细胞的液体经过另一进入管压入喷嘴，使之形成包围细胞悬液的鞘液（图压入喷嘴，使之形成包围细胞悬液的鞘液（图13-1）。）。在鞘液和细胞悬液存在一定压力差的情况下，中央的细在鞘液和细胞悬液存在一定压力差的情况下，中央的细胞悬液和周围鞘液的分层液流快速通过胞悬液和周围鞘液的分层

6、液流快速通过50m的喷嘴圆孔，的喷嘴圆孔，被喷射出来。当同轴流动的细胞悬液和鞘液通过激光器被喷射出来。当同轴流动的细胞悬液和鞘液通过激光器发出的氩离子激光束照射小区时，发出的氩离子激光束照射小区时，单行流动单行流动的细胞发射的细胞发射出荧光，出荧光，荧光检测器荧光检测器接受聚焦后的荧光信号。接受聚焦后的荧光信号。 多数流式细胞仪可以同时收集两种以上不同波长多数流式细胞仪可以同时收集两种以上不同波长的荧光信号，检测细胞膜表面或细胞内荧光分子的数量。的荧光信号，检测细胞膜表面或细胞内荧光分子的数量。散射光检测器散射光检测器则接受细胞散射偏转后的则接受细胞散射偏转后的激光束信号激光束信号，此此信号可

7、反映细胞的物理化学特性、大小、数量和类型信号可反映细胞的物理化学特性、大小、数量和类型。 前向角散射强度信号与细胞的大小有关。散射光强度信前向角散射强度信号与细胞的大小有关。散射光强度信号则反映细胞内部结构，即流式细胞仪可以同时收集两号则反映细胞内部结构，即流式细胞仪可以同时收集两个方向散射光的信号。两种光检测器所产生的信号，经个方向散射光的信号。两种光检测器所产生的信号，经过电子系统的处理，产生脉冲，并使测量过的细胞在形过电子系统的处理，产生脉冲，并使测量过的细胞在形成微滴时，带上不同的电荷（充电）。成微滴时，带上不同的电荷（充电）。 当充电微滴通过带有恒定静电压的偏转板时，带正当充电微滴通

8、过带有恒定静电压的偏转板时，带正电荷的细胞微滴在静电场作用下落入左方的细胞收集器，电荷的细胞微滴在静电场作用下落入左方的细胞收集器，而带负电荷的细胞微滴落入右方的细胞收集器，不带电而带负电荷的细胞微滴落入右方的细胞收集器，不带电荷的细胞微滴落入中央的容器中，荷的细胞微滴落入中央的容器中，从而实现细胞分选的从而实现细胞分选的目的。目的。这种分类技术能以每秒高达这种分类技术能以每秒高达500010000个细胞的个细胞的速度分类细胞，纯度在速度分类细胞，纯度在90%99%之间，细胞活性在通过之间，细胞活性在通过仪器过程中不受影响。仪器过程中不受影响。流式细胞仪仅对悬浮细胞进行分流式细胞仪仅对悬浮细胞

9、进行分析和测量，析和测量，并进行统计学分析，但无法得到细胞的形态并进行统计学分析，但无法得到细胞的形态学以及多种动力学功能参数，尤其不能满足细胞的解剖学以及多种动力学功能参数，尤其不能满足细胞的解剖定位研究。定位研究。第二节第二节 单细胞悬液的制备单细胞悬液的制备 流式细胞术所得结果好坏首先取决于细胞样品处理流式细胞术所得结果好坏首先取决于细胞样品处理制备方法的优劣。所以，要保证细胞在制备过程中和储存制备方法的优劣。所以，要保证细胞在制备过程中和储存期间细胞表面和细胞内部的成分不被破坏和去失，特别是期间细胞表面和细胞内部的成分不被破坏和去失，特别是要分析的那些成分。要分析的那些成分。 一、单层

10、细胞培养一、单层细胞培养 使用标准培养技术，单层生长的细胞容易分离。单层使用标准培养技术，单层生长的细胞容易分离。单层细胞用细胞用PBS或或Hanks平衡液加平衡液加0.25% Trypsin洗，当细胞洗，当细胞变圆时（在倒置显微镜下观察），倒出变圆时（在倒置显微镜下观察），倒出Trypsin液体后用液体后用手拍打振动培养瓶使细胞脱落，然后加入缓冲液摇动培养手拍打振动培养瓶使细胞脱落，然后加入缓冲液摇动培养瓶并用细管取出含有细胞的上清液。瓶并用细管取出含有细胞的上清液。 二、组织二、组织 从新鲜组织制备单个细胞悬液，有的比较容易，例从新鲜组织制备单个细胞悬液，有的比较容易，例如淋巴结组织用注射

11、器反复抽吸几次即可得到足够量的如淋巴结组织用注射器反复抽吸几次即可得到足够量的细胞；有的就比较困难，常要用机械分散和酶消化相结细胞；有的就比较困难，常要用机械分散和酶消化相结合的方法处理，如肝、睾丸用酶消化处理很容易得到单合的方法处理，如肝、睾丸用酶消化处理很容易得到单个细胞。但睾丸生殖细胞胞质之间桥接引起相邻细胞溶个细胞。但睾丸生殖细胞胞质之间桥接引起相邻细胞溶解，形成人为的称为合胞体的多核假象。很难与解，形成人为的称为合胞体的多核假象。很难与DNA含含量和体积上相似的单个细胞区分开。神经细胞的处理参量和体积上相似的单个细胞区分开。神经细胞的处理参见细胞培养。见细胞培养。 三、血细胞制备方法

12、三、血细胞制备方法 （一）全血溶解技术（一）全血溶解技术 通过选择性的溶解红细胞，获得外周血中单个核细胞通过选择性的溶解红细胞，获得外周血中单个核细胞和多形核细胞。和多形核细胞。 1试剂试剂 氯化铵溶解缓冲液氯化铵溶解缓冲液pH7.3。细胞洗涤缓冲液：细胞洗涤缓冲液：不含钙镁的不含钙镁的Hanks平衡盐液或平衡盐液或1PBS缓冲液。缓冲液。 2方法方法 （1）取）取0.51ml用肝素或用肝素或EDTA抗疑的外周血，加入抗疑的外周血，加入15ml离心管内，加离心管内，加20倍于血体积的氯化铵溶液混匀，室温倍于血体积的氯化铵溶液混匀，室温下溶解下溶解8l0min（红细胞完全溶解应为透明红色）。红细

13、胞完全溶解应为透明红色）。 （2）180g离心离心5min，小心吸出上清，然后把沉淀的小心吸出上清，然后把沉淀的白细胞用细胞洗涤缓冲液洗两次，白细胞用细胞洗涤缓冲液洗两次，80g离心离心5min。吸出上吸出上清，再把细胞悬浮在冷的缓冲介质中备用。清，再把细胞悬浮在冷的缓冲介质中备用。 （二）梯度（二）梯度-密度离心分离法密度离心分离法 该方法可离出单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）。该方法可离出单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）。 1材料材料 淋巴细胞分离液；淋巴细胞分离液；PBS缓冲液。缓冲液。 2方法方法 （1）所用试剂预热到）所用试剂预热到25以获得正确的密度。以获得正确的密度。 （2）取）

14、取5ml外周血用肝素或外周血用肝素或EDTA抗凝，并加等体积抗凝，并加等体积的的PBS稀释混匀。加稀释混匀。加2ml淋巴细胞分离液到圆锥形离心管淋巴细胞分离液到圆锥形离心管的底部，用吸管取的底部，用吸管取5ml用用PBS稀释的抗凝血小心地放到淋稀释的抗凝血小心地放到淋巴细胞分离液液面上，注意不要使之混合。巴细胞分离液液面上，注意不要使之混合。 （3）室温下）室温下400g离心离心20min，使离心管自行缓慢停使离心管自行缓慢停下，不要用力强迫离心停车。丢弃血浆，用细尖长吸管吸下，不要用力强迫离心停车。丢弃血浆，用细尖长吸管吸出含有单个核细胞的淡黄色层，置另一个离心管内。出含有单个核细胞的淡黄色

15、层，置另一个离心管内。 （4）加）加10ml PBS 600g离心离心10min，洗两次。把细洗两次。把细胞在悬浮在胞在悬浮在2ml的的PBS中备用。中备用。 四、石蜡标本制备单细胞悬液四、石蜡标本制备单细胞悬液 （1）修块：切去多余的坏死组织和基质组织。切）修块：切去多余的坏死组织和基质组织。切5片片50m厚蜡片标本放在一个厚蜡片标本放在一个10ml的试管里。的试管里。 （2）脱蜡：加入）脱蜡：加入5ml二甲苯，二甲苯，10min3次。次。 （3）水化：）水化：100%乙醇乙醇510min2次；次；95%乙醇乙醇5l0min2次；次；70%乙醇乙醇510min2次；次；50%乙醇乙醇510m

16、in2次；蒸流水洗次；蒸流水洗5min3次，丢弃蒸流水。次，丢弃蒸流水。 （6）消化：加入）消化：加入5ml 0.5%胃蛋白酶消化液（生理盐胃蛋白酶消化液（生理盐水配制）水配制）37保温保温3050min，每隔每隔10min振荡一次。用振荡一次。用镊子或玻璃棒取出未消化完的组织，并加等量生理盐水镊子或玻璃棒取出未消化完的组织，并加等量生理盐水终止酶的作用。经终止酶的作用。经50m尼龙网过滤。尼龙网过滤。 五、细胞固定五、细胞固定 固定的目的是使细胞或组织硬化足以承受包固定的目的是使细胞或组织硬化足以承受包埋和切片的处理。固定也使得细胞膜变得通透，埋和切片的处理。固定也使得细胞膜变得通透，使染料

17、能够进入，获得最佳染色效果、并通过抑使染料能够进入，获得最佳染色效果、并通过抑制微生物作用和自溶保护细胞样品。作为流式细制微生物作用和自溶保护细胞样品。作为流式细胞术，细胞以悬浮状态使用，常用的固定剂有乙胞术，细胞以悬浮状态使用，常用的固定剂有乙醇、甲醇、甲醛和戊二醛等。醇、甲醇、甲醛和戊二醛等。DNA定量分析细胞定量分析细胞多用乙醇固定，免疫表型分析常用甲醛和多聚甲多用乙醇固定，免疫表型分析常用甲醛和多聚甲醛等固定以保护细胞膜表面的特异标志物。醛等固定以保护细胞膜表面的特异标志物。 1乙醇固定乙醇固定 常用常用75%乙醇。用无钙镁的乙醇。用无钙镁的PBS配配制，制，4冰箱中保存。将洗过的细胞

18、用冰箱中保存。将洗过的细胞用0.5ml PBS悬浮起悬浮起来，用加样器或吸管把细胞悬液喷射入来，用加样器或吸管把细胞悬液喷射入5ml 75%冷乙醇冷乙醇中。将容器口密封，中。将容器口密封，4冰箱贮存，时间不少冰箱贮存，时间不少30min。 2免疫染色后的固定免疫染色后的固定 对细胞表面抗原进行免疫对细胞表面抗原进行免疫标记染色后，如果不能立即进行标记染色后，如果不能立即进行FCM分析，可用下列方分析，可用下列方法固定保存：法固定保存： （1）在细胞免疫标记染色完成细胞洗涤后，加入）在细胞免疫标记染色完成细胞洗涤后，加入3%的甲醛，细胞摇匀后的甲醛，细胞摇匀后4冰箱保存。冰箱保存。24h之内分析

19、，之内分析，其荧光强度不变。其荧光强度不变。 （2）用）用0.5%的多聚甲醛摇匀固定，的多聚甲醛摇匀固定，4冰箱保存，冰箱保存，一周内荧光强度基本不变。一周内荧光强度基本不变。第三节第三节 细胞的荧光标记细胞的荧光标记 流式细胞术对细胞的分析一是分析细胞产生流式细胞术对细胞的分析一是分析细胞产生的散射光信号；二是分析细胞所产生的荧光信号。的散射光信号；二是分析细胞所产生的荧光信号。细胞的荧光是由一些能够定量的荧光染料与细胞细胞的荧光是由一些能够定量的荧光染料与细胞内的特有成分结合，或经抗原抗体反应使荧光染内的特有成分结合，或经抗原抗体反应使荧光染料与细胞间接结合，经激光照射产生的。本节主料与细

20、胞间接结合，经激光照射产生的。本节主要介绍荧光染料直接与细胞内部特有成分结合定要介绍荧光染料直接与细胞内部特有成分结合定量分析的荧光标记方法，如量分析的荧光标记方法，如DNA、RNA、蛋白等。蛋白等。 一、常用荧光染料一、常用荧光染料 在流式细胞术中使用的荧光染料可分两大在流式细胞术中使用的荧光染料可分两大类：一类是染料生物大分子基团，如免疫球蛋类：一类是染料生物大分子基团，如免疫球蛋白，再与细胞发生免疫反应，使染料分子间接白，再与细胞发生免疫反应，使染料分子间接地连接到细胞上（表地连接到细胞上（表13-1）；另一类是直接与）；另一类是直接与细胞内特异成分相结合的染料，它们之间有非细胞内特异成分相结合的染料，它们之间有非常好的线性关系（表常好的线性关系（表13-2）。在实验过程中，）。在实验过程中，应根据仪器的实际情况，例如激发光源