酶联免疫吸附试验-研究生20140113

1、实验一实验一 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)(ELISA) 抗原抗原 抗体抗体 抗原抗体反应抗原抗体反应HvLvHcLc 抗原抗体反应的特征抗原抗体反应的特征 “Lock and Key” 模式模式: 高度特异性高度特异性 非共价键结合非共价键结合 氢键、静电引力、范德华力、疏水键氢键、静电引力、范德华力、疏水键 可逆性结合可逆性结合亲和力；亲合力亲和力；亲合力抗原抗体比例抗原抗体比例抗原的理化性质抗原的理化性质温度温度: 3756PH值值: 68离子浓度离子浓度: 0.9% NaCl 影响抗原抗体反应的因素影响抗原抗体反应的因素 凝集反应凝集反应 沉淀反应沉淀反应 补体结合反

2、应补体结合反应 中和反应中和反应 经典抗原抗体反应经典抗原抗体反应免疫标记技术免疫标记技术定义：定义： 将抗原将抗原- -抗体反应与标记技术相结合，用抗体反应与标记技术相结合，用放射放射性同位素、酶或荧光素性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：分类： 放射免疫测定法：放射免疫测定法：131131I I，3232P P 免疫荧光技术：免疫荧光技术：FITC(FITC(异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素) )，PE(PE(藻红蛋白藻红蛋白) ) 免疫酶测定法：免疫酶测定法：HRPHRP，A

3、PAP免疫酶测定法免疫酶测定法酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。中未知抗体或抗原的方法。将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体检测液相中未知抗体将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原检测液相中的可溶性抗原将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试

4、验（以双抗体夹心法为例）（以双抗体夹心法为例）：EE结果判定：结果判定： 定性检测定性检测 定量检测定量检测定量检测：定量检测：实验内容：实验内容： 双抗体夹心法测定乙肝表面抗原双抗体夹心法测定乙肝表面抗原实验材料实验材料包被板：已包被抗包被板：已包被抗-HBs-HBs的酶标板的酶标板酶结合物：酶标记抗酶结合物：酶标记抗-HBs-HBs底物液：底物液： OPD 10mgOPD 10mg，底物缓冲液，底物缓冲液25ml25ml，30% H30% H2 2O O2 2 40L 40L显色剂：显色剂：洗涤液：含洗涤液：含0.05% Tween 200.05% Tween 20的的0.01M pH7.

5、4 PBS0.01M pH7.4 PBS终止液：终止液：2% H2% H2 2SOSO4 4阴性对照阴性对照阳性对照阳性对照取出包被好抗体的酶标板，室温平衡（取出包被好抗体的酶标板，室温平衡（7 7孔孔/ /组）组）加待测血清加待测血清标记各孔，加入稀释液体标记各孔，加入稀释液体20L/20L/孔孔1234阴性阴性 阳性阳性加二抗：加二抗：各孔加入相应试剂各孔加入相应试剂100L/100L/孔孔, ,轻轻震荡混匀轻轻震荡混匀3737，湿盒内，湿盒内，45mins,45mins,甩干孔内液体甩干孔内液体加入底物加入底物并显色：并显色：弃净上清，以洗涤液（弃净上清，以洗涤液（200L/200L/孔

6、）洗涤孔）洗涤6 6次，次，1min/1min/次，次，每次扣干残液每次扣干残液加入底物溶液加入底物溶液50L/50L/孔，混匀孔，混匀3737，避光显色，避光显色， 30min30min观察结果观察结果实验方法实验方法空白空白实验实验加入终止液加入终止液50L/50L/孔孔酶标仪检测酶标仪检测450nm450nm波长下波长下ODOD值，值，如果为定性肉眼观察即可如果为定性肉眼观察即可加酶加酶 每孔加入酶标抗体每孔加入酶标抗体50ul,50ul,混匀后，混匀后，温育温育 37 37温育温育30min30min注意事项：注意事项： 标本的采取和保存：根据不同标本保存和处理标本的采取和保存：根据不同标本保存和处理 准备试