脊髓损伤后MMP

1、脊髓损伤后MMP作者：周华，刘华 (苏州大学附属第一医院创伤急诊外科，江苏 苏州 215006;苏州卫生学校康复医学教研室，江苏 苏州 215002)摘要：目的 通过研究大鼠急性脊髓损伤后基质金属蛋白酶9(MMP9)表达的时空变化，探讨基质金属蛋白酶9在急性脊髓损伤后的作用。方法 使用改良Allen法制作大鼠急性脊髓损伤模型，检测脊髓损伤后基质金属蛋白酶9在损伤脊髓中表达的时空分布特点。结果 损伤组急性脊髓损伤后1小时，可见基质金属蛋白酶9的表达，损伤后12天达到高峰，7天仍有表达。阳性细胞主要表达在缺血神经元、血管内皮细胞和嗜中性粒细胞。对照组未见基质金属蛋白酶9表达。结论 基质金属蛋白酶9

2、在脊髓损伤后的早期表达，提示基质金属蛋白酶9可能参与脊髓损伤后水肿形成和炎性细胞的浸润，加重了继发性脊髓损伤。关键词：基质金属蛋白酶9;脊髓损伤;细胞Expression of matrix metalloproteinase9 after acute spinal cord injuryZHOU Hua,LIU Hua(Department of Traumatology,First Affiliated Hospital of Suzhou University,Suzhou 215006,China)Abstract：Objective To investigate the early

3、expression of matrix metalloproteinase9 after actue spinal cord injury.Methods The models of spinal cord injury in rats were induced with Allen's way and the expression of matrix metalloproteinase9 in injuried spinal cord was observed.Results The expression of matrix metalloproteinase9 increased

4、 6h after spinal cord injury，which reached its peak 1,2 days after spinal cord injury(SCI).The matrix metalloproteinase9 positive cells were mainly expressed on ischemia neuron, angioendothelial cells and neutrophile.The express of matrix metalloproteinase9 wasn't found in the shamoperated rats.

5、Conclusion The early matrix metalloproteinase9 may be partially involved in the secondary pathogenesis of spinal cord injury.Key words：matrix metalloproteinase9;spinal cord injury;cell脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)造成的神经损伤由2种机制引起，即原发性损伤和继发性损伤，前者包括机械性压迫、出血等，其产生的神经损伤是不可逆的;后者包括水肿、炎症反应、局部缺血等，特别是其中的水肿与能量代谢系

6、统障碍可引起一系列放大效应，使SCI更加恶化。基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9,MMP9)能通过蛋白水解作用破坏毛细血管紧密连接和基底膜，导致脑微血管通透性增加、血脑屏障破坏、脑水肿形成，继而致脑组织损伤1,2。本实验通过检测急性脊髓损伤后损伤脊髓中MMP9表达的时空特点，探讨MMP9在继发性脊髓损伤中的作用。材料与方法1 动物分组和模型制作健康雄性SD大鼠70只，体重200250g，由武汉同济医学院实验动物中心提供。根据随机数字表编号，随机分为2组：对照组和损伤组。对照组大鼠35只，100g/L水合氯醛(350mg/kg体重)腹腔注射麻醉成功后，仅做椎板切

7、除术;损伤组大鼠35只，100g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，按改良Allen法，暴露T8、T9节段脊髓背侧，将10g条形重物通过立体固定仪，于2.5cm高度垂直打击该段脊髓后正中制作SCI模型。2组分别于术后1、6、12小时、1、3、5、7天(每时相点5只)处死取材。每只大鼠术毕立即肌注青霉素钠10万U，待麻醉苏醒后进行下肢运动功能评定(约在术后1小时)，采用美国SCI学会提出的运动评分法(America spinal injury association motor score,ASIAMS)，选取评级为A、B级的大鼠。术后每天8:00、17:00两次人工膀胱排尿，直至建立反射性膀胱排空(约5

8、天)。室温保持在2025。2 MMP9的免疫组化检测大鼠按各时相点麻醉后，经左心室主动脉插管，40g/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液灌流，完整取出脊髓组织。切取T8、T9脊髓组织，石蜡包埋,连续切片，片厚5m。每个组织块随机取连续的3张切片。MMP9兔多抗购自武汉博士德生物工程公司，SP试剂盒购于北京中山生物技术有限公司。具体步骤如下：(1)常规石蜡包埋;(2)石蜡切片常规脱蜡;(3)30g/L过氧化氢，室温反应10分钟，蒸馏水漂洗2分钟×3次;(4)热修复抗原：将切片浸入0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)，微波炉加热至沸腾后断电冷却，反复12次，0.01mo

9、l/L PBS洗涤2分钟×3次;(5)加正常山羊血清封闭液，室温下孵育2小时;(6)滴加一抗MMP9兔多抗(浓度1:100)，37孵育过夜;(7)滴加生物素化羊抗兔IgG，室温下反应20分钟;(8)滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温下反应20分钟，0.01mol/L PBS洗涤5分钟×3次;(9)3.3二氨基苯联胺(diaminobenzidine,DAB)显色;苏木素复染;中性树脂封片。阴性对照实验采用替代法，用PBS代替一抗、二抗及辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液做上述操作，结果为阴性。3 图像分析采用HPIAS1000高分辨彩色病理图像报告分析系统XZ

10、S进行图像分析处理。取各大鼠损伤断面水平的连续组织切片，各组每个时相点5只大鼠，每只大鼠选取1张切片。每张切片在损伤区(对照组在假手术区)随机采集5个高倍镜(400倍)视野，测定切片的平均吸光度值(A值)。阳性细胞数越多，A值越大，提示免疫反应越强。4 统计学处理所有数据以均数±标准差(±s)表示，A值采用组内t检验进行统计学处理。P<0.05表示有显著性差异。结果1 急性损伤脊髓组织中MMP9的A值变化对照组检测不出MMP9的表达，损伤组伤后1小时即有MMP9的阳性表达，6小时后A值逐渐增大，在1天达到高峰，以后开始减少，在SCI后7天仍可检测得到。各时相点A值比较

11、显示，SCI后6小时与1小时有差异，在SCI后1天与各时相点比较均有显著性差异，7天与6小时比较无显著性差异(见图1)。2 MMP9的表达对照组脊髓组织未见MMP9的表达(见图2)。脊髓损伤区可见MMP9免疫阳性细胞，主要表达在缺血神经元、血管内皮细胞、中性粒细胞等细胞的胞浆。免疫阳性细胞胞浆呈现棕黄色淡染，细胞核蓝染(见图3)。损伤6小时后，MMP9表达增加，其中13天达高峰，之后开始下降(见图1)。图1 急性脊髓损伤后不同时相点A值 (略)图2 对照组未见MMP9的表达(免疫组化SP法×40)(略)图3 SCI后1天损伤区MMP9(免疫组化SP法×400)(略)讨论基质

12、金属蛋白酶是一类能降解细胞外基质成分的蛋白水解酶，由多种细胞合成分泌，包括毛细血管内皮细胞、中性粒细胞及某些正常细胞。其中基质金属蛋白酶9(MMP9)是最重要的一种，能降解内皮基底膜，使血脑屏障开放1,2。它的作用在颅脑损伤中研究较多，在SCI中的作用国内外的研究报道尚不多。1 SCI后MMP9表达的时间分布本实验动态观察比较了损伤后不同时间MMP9蛋白在损伤脊髓组织中的表达水平，发现对照组中检测不到MMP9蛋白表达的阳性细胞。损伤组各时间点损伤组织周围均出现大量棕黄色的阳性细胞，着色部位主要在细胞浆，损伤后1小时开始表达，1天达高峰(在SCI后1天与各时相点比较均有显著性差异，P<0.

13、05)，以后逐渐下降，这说明SCI可能诱导了MMP9的表达。在SCI的过程中，机体发生了一系列结构、代谢和机能的改变。SCI后，受损部位局部微循环严重障碍，导致血流量下降，并因某些活性因子的释放，包括血栓素、血小板激活因子、5羟色胺及内源性阿片物质而引起血管舒张收缩反应异常，致使毛细血管通透性增加，红细胞聚集，血小板激活，血流速度减慢，导致脊髓组织进一步缺血缺氧并发生严重水肿。缺血、缺氧作为一种信号，刺激炎性细胞、神经元、内皮细胞和胶质细胞，激活MMPs系统，导致MMP9的表达上调3。2 SCI后MMP9表达的空间分布急性SCI后早期MMP9免疫阳性反应主要发生在缺血神经元、内皮细胞和中性粒细

14、胞。研究表明，内皮细胞和中性粒细胞在MMP9造成血脊髓屏障的崩溃和组织损伤中起关键性作用4。内皮细胞可分泌基质金属蛋白酶，包括基底面的MMP9，从而促进基底膜的降解。血管下基底膜细胞外基质成分的蛋白水解，将直接导致血管通透性增加和完整性的破坏5。光镜观察发现，损伤后大鼠SCI区存在明显的水肿。在脊髓水肿中，由于细胞毒性物质的作用使细胞能量代谢发生障碍，导致细胞内外正常离子浓度梯度消失，内皮细胞受损，血管通透性增加，血液成分渗出导致血管源性水肿的形成。中性粒细胞表达MMP9与其在组织损伤后某个时段的移行有关6;中性粒细胞由血液循环侵入组织时，需要MMP9的帮助;而中性粒细胞本身也表达MMP9，可

15、能进一步促进其侵入组织，并可通过蛋白水解作用在组织中游走，通过自身炎性破坏作用直接侵犯神经细胞，加重了缺血性损伤7。炎性细胞在损伤脊髓组织中聚集并释放出某些活性物质，导致损伤组织周围产生缺血和炎症反应，进而加重脊髓水肿。而脊髓水肿能促进炎性细胞的聚集，两者相互促进，进一步加重了继发性SCI。我们推测，内皮细胞和中性粒细胞在MMP9造成的急性SCI后组织水肿和炎性细胞的浸润中起关键性作用。参考文献：1Bruno G,Todor I,Lewis D,et al.Vascular extracelluar matrix remodeling cerebral aneursmsJ.J Neurosur

16、g,1998,89(3):431-440.2刘华,廖维靖,杨万同,等.脑缺血再灌后MMP9的表达与血脑屏障的破坏J.中华物理医学与康复杂志,2004,26(4):203-205.3Duchossoy Y,Horvat JC,Stettler O.MMPrelated gelatinase activity is strongly induced in scar tissue of injured adult spinal cord and forms pathways for ingrowing neuritesJ.Mol Cell Neurosci,2001,21:945-956.4Ferg

17、uson TA,Muir D.MMP2 and MMP9 increase the neuritepromoting potential of schwann cell basal laminae and are upregulated in degenerated nerveJ.Mol Cell Neurosci,2000,16:157-167.5Zhang ZG,Zhang L,Tsang W,et al.Dynamic platelet accumulation at the site of the occluded middle cerebral artery and in downstream microvessels is associated with loss of microvascular integrity after embolic middle cerebral artery occlusionJ.Brain Res,2001,912(2):181-194.6Rosenberg GA,Estrada EY,Dencoff JE.Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with bloodbrain ba