静电纺丝纳米纤维膜作为骨骼肌组织工程支架材料的细胞相容性

1、中国组织工程研究与临床康复 第15卷 第12期 20110319出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research March 19, 2011 Vol.15, No.12静电纺丝纳米纤维膜作为骨骼肌组织工程支架材料的细胞相容性*梁 爽，李 权，唐休发，冯 扬，何等旗23Cytocompatibility of electro-spinning nano-fibrous scaffolds for skeletal muscle tissue engineeringLiang Shuang1, Li Quan1, T

2、ang Xiu-fa2, Feng Yang1, He Deng-qi3AbstractLiang S, Li Q, Tang XF, Feng Y, He DQ.Cytocompatibility of electro-spinning nano-fibrous scaffolds for skeletal muscle tissue engineering. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(12):2171-2174. State Key Laboratory of Oral Disease, Che

3、ngdu 610041, Sichuan Province, China; 2Department of Head and Neck Oncology, West China College ofStomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; 3Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, ChinaLiang Shu

4、ang, Studying for masters degree, State Key Laboratory of Oral Disease, Chengdu 610041, Sichuan Province, China nancy1986xx Correspondence to: Tang Xiu-fa,Professor, Doctoral supervisor,Department of Head and Neck Oncology, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichu

5、an Province, ChinaSupported by: Doctor Subject Foundation of the Ministry of Education of China, No.20050610077*; the National Natural Science Foundation of China, No. 30872890*Received: 2010-10-15 Accepted: 2010-11-21摘要梁爽，李权，唐休发，冯扬，何等旗.静电纺丝纳米纤维膜作为骨骼肌组织工程支架材料的细胞相容性J.中国组织工程研究与临床康复，2011，15(12):2171-21

6、74. 0 引言骼肌组织工程的需要7-11。研究表明，采用静电纺丝技术制得的无纺布具有孔隙率高、表面积大、均一性好等特点，并可从纳米尺度模仿天目前人们已利用组织工程技术获得了组织然的细胞外基质，促进细胞的迁移和增殖。本实验拟初步探讨利用电纺技术制备聚乳酸、蚕丝蛋白和胶原共混物支架材料的细胞相容性。1 材料和方法 设计：随机对照细胞学体外实验。 时间及地点：于2009-02/05在口腔疾病研工程化皮肤1-3、骨组织和软骨组织等4-6，有部分工程化组织进行了临床试用，获得了初步成果3。关于骨骼肌组织工程支架材料，目前文献已报道很多种。有学者报道以生物可降解的

7、胶原盘，也有以聚L-乳酸、聚羟基乙酸、聚L-乳酸/聚羟基乙酸共聚物等作为骨骼肌组织工程的支架材料，各有优缺点，不能完全满足骨ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 2171www.CRTER.org 1 梁爽，等. 静电纺丝纳米纤维膜作为骨骼肌组织工程支架材料的细胞相容性 口腔疾病研究国 家重点实验室， 四 川 省 成 都 市 2 610041； 华西口 腔医院头颈肿瘤 外科， 四川省成都 市 610041； 3 兰 州大学第二附属 医院口腔科， 甘肃 省 兰 州 市 730030 梁爽， 1986 女， 年生，重庆市人， 汉族， 四川大学华 西口腔

8、医学院在 读硕士， 主要从事 骨骼肌组织工程 支架材料研究。 nancy1986xx 通讯作者：唐休 发，教授，博士生 导师， 华西口腔医 院头颈肿瘤外科， 四川省成都市 610041 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2011)12-02171-04 收稿日期： 2010-10-15 修回日期： 2010-11-21 (20101015005/GW Y) 究国家重点实验室完成。 材料： 出生3 d内的雄性SD乳鼠购自四川大 学实验动物中心。不同组分静电纺丝纳米纤维 膜由四川大学生物材料实验室提供。将静电纺 丝纳米纤维膜分为以下7组：纯聚乳酸组、60% 聚乳

9、酸+30%蚕丝蛋白+10%胶原组、60%聚乳 酸+40%蚕丝蛋白组、70%聚乳酸+30%蚕丝蛋 白组、 80%聚乳酸+10%蚕丝蛋白+10%胶原组、 80%聚乳酸+20%蚕丝蛋白组、70%聚乳酸+ 20%蚕丝蛋白 + 10%胶原组。 实验方法： 成肌细胞的制取与培养： 参照Blau等 12-13 材料的细胞相对数。取每组余下孔中材料，洗 涤，置2.5%戊二醛4 过夜。不同浓度乙醇梯 度脱水后置醋酸异戊酯中置换，扫描电镜检测 成肌细胞在实验材料中的黏附情况。 黏附率=实验材料组平均吸光度/对照组平均吸光度 主要观察指标：成肌细胞在各组材料的黏 附及生长情况。 统 计 学 分 析 ： 采 用 SP

10、SS 11.5 进 行 ANOVA分析和LSD分析，统计学分析由第一、 的方 二作者同完成。 2 2.1 结果 成肌细胞的培养情况 在倒置显微镜下 法，无菌条件下分离SD雄性乳鼠四肢肌肉， PBS液洗后置于双抗，剪碎成1 mm3大小，移 入培养瓶，胶原酶和胰蛋白酶分3次消化。收集 细胞悬液，终止消化。离心，取沉淀，制成细 胞悬液，差速贴壁3次。以1×10 L 浓度接种于 培养瓶中，在37 、体积分数5%CO2孵箱培 养。3 d后换液，后每隔2 d换液。待细胞长满瓶 底80%时传代。 静电纺丝纳米纤维膜浸提液的制备：无菌条件 7 -1 可见差速贴壁后的培养瓶底有明显的细胞贴 壁 生 长

11、 。 培养 基 中 见 大量 悬 浮 细 胞 (呈 圆 球 形)。30 min后开始贴壁，48 h贴壁完全。贴 壁后的成肌细胞双极伸展、呈长梭形、单核、 有折光性。三四天后，细胞排列规律、相互平 行，并有集落样细胞生长。 2.2 静 电 纺丝 纳 米 纤维膜 的 细 胞毒性 实 验 由图1生长曲线可以看出成肌细胞在接种后的 第1天处于恢复期。在第一二天时细胞数量增 加较少。从第2天开始便进入指数增长期，直 到第4天。 第五六天为平台期。 第6天以后细胞 数量开始下降，说明成肌细胞进入衰退期。 取各组静电纺丝纳米纤维膜，剪碎移至6孔板。 每 组 3 个 培 养 板 。 每 孔 材 料 面 积 为

12、 10 mm× 60 mm。按中华人民共和国国家标准之医疗器 械生物学评价的第12部分样品制备与参照样 品(GB/T 16886.2-2005) 14 ，以含体积分数20% 新生小牛血清的培养基作为浸提介质(每6 cm2 材料/1 mL浸提介质)。浸提条件(37±1) ， 24 h。每组获18 mL浸提液。移入无菌玻璃瓶， 标记，置于4 冰箱备用。 MTT比色法检测静电纺丝纳米纤维膜的细胞毒 性：取第3代成肌细胞按2×10 L 的浓度接种于 7 -1 2 1.2 0 1.0 group 1 2 Mean A value 96孔板(200 µL/孔)，培养

13、24 h。将各组静电纺 丝纳米纤维膜浸提液及对照组(加体积分数20% 新生小牛血清的F12培养基)加入到96孔板(横 向12孔为同组浸提液)。于培养1，2，3，4，5， 6 d时分别取出每组4个孔的细胞，在570 nm波 长下测定其吸光度(A值)值，结果以x±s表示， 并绘制生长曲线。 静电纺丝纳米纤维膜预处理及接种成肌细胞： _ 8 0.8 6 0.6 3 4 4 0.4 5 6 7 8 2 0.2 0 0.0 1 2 3 4 Time (d) 5 6 将各组静电纺丝纳米纤维膜浸提液经紫外光照 射及预湿处理，每组材料设计成5复孔(4孔MTT 法、1孔扫描电镜法)，设立一空白对照组。

14、第3 代成肌细胞按2×107L-1 的浓度接种于24孔板 (1 mL/孔)，2次沉淀法接种于材料。 检测成肌细胞在静电纺丝纳米纤维膜中的黏附 能力：培养5 d后开始用MTT比色法测定黏附于 2172 1-8: pure group, 60% PLA + 30% silk fibroin + 10% collagen group, 60% PLA + 40% silk fibroin group, 70% PLA +30% silk fibroin group, 80% PLA +10% silk fibroin+10% collagen group, 80% PLA +20% sil

15、k fibroin group, 70% PLA + 20% silk fibroin + 10% collagen group, control group; PLA: poly lactic acid Figure 1 Myoblast growth curve detected by MTT 图 1 MTT 法检测各组成肌细胞生长曲线 2.3 成肌细胞在纤维膜中的黏附情况 见图2。 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 梁爽，等. 静电纺丝纳米纤维膜作为骨骼肌组织工程支架材料的细胞相容性 www.CRTER.org 表 1 以对照组为标准计算各组成肌细胞的黏附率

16、Table 1 Adhesion rate of myoblasts in each group Group 1 2 3 4 5 6 7 8 x±s 0.101±0.005 0.262±0.006 0.203±0.014 0.231±0.005 0.558±0.006 0.556±0.004 0.626±0.004 0.743±0.020 _ Adhesion rate (%) 13.55 35.21 27.28 31.11 75.03 74.86 84.21 a: 1 group (1 000 kV,

17、×800) b: 2 group (1 000 kV, ×800) PLA: poly lactic acid; 1-8: pure group, 60% PLA + 30% silk fibroin + 10% collagen group, 60% PLA + 40% silk fibroin group, 70% PLA + 30% silk fibroin group, 80% PLA + 10% silk fibroin + 10% collagen group, 80% PLA + 20% silk fibroin group, 70% PLA + 20% si

18、lk fibroin + 10% collagen group, control group 70%聚乳酸+20%蚕丝蛋白+10%胶原组黏附最好。 c: 3 group (1 000 KV, ×800) d: 4 group (1 000 kV, ×800) 对其进行方差分析，差异有显著性意义(F=3404.599， P=0.000 < 0.05)，见表2。 表 2 ANOVA 分析结果 Table 2 ANOVA analysis results Sum of squares 1.067 0.001 1.068 Mean square 0.178 0.000 Ite

19、m Between groups Within groups Total df 6 21 27 F 3 404.599 Sig. 0.000 e: 5 group (1 000 kV, ×800) f: 6 group (1 000 kV, ×800) 可以认为成肌细胞在材料中的黏附率差异有显著 性意义。用LSD法所分析的各组之间黏附率差异有显著 性意义，见表3。 除80%聚乳酸+10%蚕丝蛋白+10%胶原组、 80%聚 乳酸+ 20%蚕丝蛋白组外，其余各组间黏附率差异均有 显著性意义(P < 0.05)。 g: 7 group (1 000 kV, ×20

20、0) h: 7 group (1 000 kV, ×800) 1-7: pure group, 60% PLA + 30% silk fibroin + 10% collagen group, 60% PLA + 40% silk fibroin group, 70% PLA + 30% silk fibroin group, 80% PLA + 10% silk fibroin + 10% collagen group, 80% PLA + 20% silk fibroin group, 70% PLA + 20% silk fibroin + 10% collagen group

21、; PLA: poly lactic acid 表 3 各组间 LSD 分析结果 Table 3 LSD analysis results Group 1 vs. 2 1 vs. 3 1 vs. 4 1 vs. 5 1 vs. 6 1 vs. 7 2 vs. 3 2 vs. 4 2 vs. 5 2 vs. 6 2 vs. 7 Mean Significance Group difference -0.161 00 -0.102 25 -0.130 50 -0.457 00 -0.455 75 -0.525 50 0.058 75 0.030 50 -0.296 00 -0.294 75 -0.

22、364 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 vs. 4 3 vs. 5 3 vs. 6 3 vs. 7 4 vs. 5 4 vs. 6 4 vs. 7 5 vs. 6 5 vs. 7 6 vs. 7 Mean difference -0.028 25 -0.354 75 -0.353 50 -0.042 325 -0.326 5 -0.325 25 -0.395 00 0.001 25 -0.068 50 -0.069 75 Significance 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.809 0.000 0.000 Fig

23、ure 2 The adhesion of myoblasts on nano-fibrous membrane 图 2 各组成肌细胞在纤维膜中的黏附情况 各组中均有成肌细胞黏附， 但以70%聚乳酸+20% 蚕丝蛋白+10%胶原组成肌细胞黏附情况为最好。 其余 6组黏附于材料上的细胞较少， 形态不规则， 为多角形， 似处于衰退期的成肌细胞。 而70%聚乳酸+20%蚕丝蛋 白+10%胶原组细胞呈长梭形，排列规律，细胞长轴相 互平行，可见到成肌细胞集落形成，黏附率在 13.55%84.21%之间(以对照组为标准计算，见表1)。 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN:

24、ZLKHAH PLA: poly lactic acid; 1-7: pure group, 60% PLA + 30% silk fibroin + 10% collagen group, 60% PLA + 40% silk fibroin group, 70% PLA + 30% silk fibroin group, 80% PLA + 10% silk fibroin + 10% collagen group, 80% PLA + 20% silk fibroin group, 70% PLA + 20% silk fibroin + 10% collagen group 2173

25、www.CRTER.org 梁爽，等. 静电纺丝纳米纤维膜作为骨骼肌组织工程支架材料的细胞相容性 不具有细胞可进行识别的特定位置信息，缺乏良好的细 3 讨论 成肌细胞是骨骼肌中具有分化增殖潜能的干细 胞，来源于中胚层干细胞，在胚胎发育过程中由间充 质细胞分化而成 15 胞亲和性。本实验用70%聚乳酸、20%蚕丝蛋白、10% 胶原共混后电纺得到的纤维膜具有良好的细胞相容性， 适合作为骨骼肌组织工程的支架材料。本实验着重于细 胞相容性中的细胞毒性和细胞在支架材料表面的黏附和 生长这两个方面。下一步研究可以探讨成肌细胞在该支 架材料中的迁移和功能，以及测定该支架材料的降解速 率，为其用于骨骼肌组织工

26、程提供更多证据。 4 参考文献 1 Zeigler FC,Landeen L,Naughton GK,et al. Tissue-engineered , three-dimensional human dermis to study extracellular matrix formation in wound healing. J Toxical Cut Ocular Toxicol.1993; 12(44)：303-312. Eaglstein WH, Falanga V. Tissue engineering and the development of Apligraft®

27、, a human skin equivalent. Clin Ther. 1997;19(5)：894-905. Naughton G, Nansbridge J, Gentzkow G, et al. A metabolically active human dermal replacement for the treatment of diabetic foot ulcers.Artif Organs.1997;21(11):1203-1210. Cima LG,Vacanti JP,Vacanti C,et al.Tissue engineering by cell transplan

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33、r cell- mediated gene therapyJ Cell Biol.1994；125(6): 1275-1287. GBT 16886.12-2005 医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备与 参照样品 Schultz E, Mc Cormick KM. Skeletal muscle satellite cells. Rev Physiol Biochem Pharmacol.1994；123: 213-257. 。在骨骼肌中它是以肌卫星细胞的形 式存在，位于肌纤维基底膜与肌膜之间，占1%5%。目 前较理想的提取方法是用二步消化法获得细胞悬液后再 用差速贴壁法进行纯化。本实验这种方法发现用新生3 d 内的乳鼠可以获得足够的成肌细胞，而且所获得的成肌 细胞形态一致，极性排列。 组织工程的目的就是研制生物组织替代品并植入体 内。替代品须满足国际上医疗器械生物安全的相关规定， 对机体无毒害作用。 中国依照国际标准ISO 10993也制定 了相应的医疗器械生物学评价的国家标准，即GBT 1688614。GBT 16886将细胞毒性试验分成3类：浸提液 试验、直接接触试验、间接