分子生物学研究法

1、分子生物学基本研究法（上）分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术第五章 扉页：扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀翅膀”，否，否则，你就不可能走在别人的前面。则，你就不可能走在别人的前面。RNA基本操作技术基本操作技术真核生物基因组真核生物基因组DNA庞大，有大量

2、重复序列，很难直庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快文库，可较快地分离到相关基因。地分离到相关基因。Trizol总总RNA提取试剂提取试剂 TIANGEN rRNA电泳后的三条特征性条带电泳后的三条特征性条带28S、18S、5S (特别是特别是28S和和18S特征性条带特征性条带) 是鉴定总是鉴定总RNA纯度纯度和完整性的重要参数。和完整性的重要参数。RNA的抽提方法RNA Extraction by TRIzol使用BioSpcetrometer分光光

3、度计进行快速检测核酸mRNA Extraction from Cell CulturemRNA Extraction from Tissue5.32. mRNA的纯化 寡聚（寡聚（dT）纤维素柱色谱法：）纤维素柱色谱法： 利用利用mRNA3端含有端含有PolyA+的特点，当的特点，当RNA流经寡聚流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，用下，mRNA被特异性地结合在柱上，再用被特异性地结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次此。经过两次此柱可得到较高纯度的柱可得到较高纯度的mRNA.图图5-14PolyATtractmRNA的

4、分离的分离纯化过程简图。纯化过程简图。每个Oligotex Kit 包括用于结合poly A+ mRNA的Oligotex 树脂，和用于洗涤、洗脱结合的mRNA的离心柱。Oligotex mRNA Kits可从总RNA中纯化mRNA，回收poly A+体外转录子。Oligotex Direct mRNA Kits 可从细胞和组织中纯化mRNA。mRNA Extraction from Total RNA5.3.3 cDNA的合成 cDNA（complementary DNA）：在体外以mRNA为模板，利用反转录酶和DNA聚合酶合成的一段双链DNA。cDNA 的合成5.3.4 cDNA文库的构建

5、 cDNA文库：文库：是指将某种生物体基因组转是指将某种生物体基因组转录的全部录的全部mRNAmRNA经反转录产生的经反转录产生的cDNAcDNA片段片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的菌中，该群体就称该生物基因组的cDNAcDNA文库。文库。基因文库的建立基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较基因组文库与基因组文库与cDNA文库的差别文库的差别 基因组文库中包含了所有基因，而基因组文库中包含了所有基因，而cDNA文库只包含表达的文库只包含

6、表达的基因，缺乏内含子和调控序列，在研究基因结构时用处不大基因，缺乏内含子和调控序列，在研究基因结构时用处不大 cDNA文库代表了文库代表了mRNA的来源，转录本在丰度上有差别，的来源，转录本在丰度上有差别，而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列 不同细胞类型制备的不同细胞类型制备的cDNA文库包含一些共同序列和独特序文库包含一些共同序列和独特序列，可用于分离差别表达的基因，基因组文库中不能列，可用于分离差别表达的基因，基因组文库中不能 基因组文库由于含有不表达序列，比基因组文库由于含有不表达序列，比cDNA文库大文库大 mRNA在不同组织之间存在丰度差异，因此在不同组织之间存在丰度差异，因此cDNA文库在构文库在构建时对于建时对于mRNA