表观遗传学之miRNA简介

1、MicroRNA报 告 内 容MicroRNA表达检测MicroRNA功能学实验MicroRNA报告基因实验MicroRNA表达MicroRNA简介1. MicroRNA简介MicroRNAs（miRNAs）是一类长度约1924nt的非编码单链RNA，通过碱基互补配对的方式与靶基因的3UTR区部分或完全互补，剪切靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译，从而起到转录后调控靶基因的表达。 miRNA的合成途径2. MicroRNA表达检测定量检测组织或细胞样本中的miRNA是功能研究的第一步，主要通过荧光实时定量PCR(Quantitative real-time PCR)、Northern Bl

2、otting方法检测miRNA的表达情况。2.1 实时定量PCR(Quantitative real-time PCR)TaqMan探针法SYBR Green 法实验流程特异的茎环逆转录引物及定量PCR引物的设计及合成样品总RNA的提取RNA定量及质量检测(1.9OD2.0)使用茎环引物进行逆转录(RNA:最少1ug/体系)qRT-PCR检测分析，得到原始数据。2.2 Northern Blotting 服务流程： 目的microRNA杂交探针的设计及合成总RNA的抽提小RNA的分离富集(5s以下RNA)聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜（可反复使用）microRNA的Northern Blotting分

3、析（每个杂交管只能杂一个miRNA）出具杂交图片l microRNA的杂交图片，内参：6snRNA。3. MicroRNA报告基因实验采用microRNA报告基因试验寻找microRNA的靶基因，分为初筛及突变试验。初筛：将候选靶基因的3UTR区构建至荧光素酶报告基因下游，然后将之与目的microRNA前体或mimic共转染293T或Hela细胞系，然后通过比较处理组与对照组的荧光素酶活性。突变试验：构建已突变靶位点的荧光素酶报告基因载体，然后继续使用荧光素酶报告基因试验验证初筛的结果。 pGL3载体图谱5UTR3UTR 载体构建过程荧光素酶报告基因5UTR3UTR靶基因靶位点PCR双酶切-连

4、接5UTR3UTR靶位点荧光素酶报告基因+靶基因3UTRXba Sac荧光素酶报告基因+靶基因3UTRmiRNA载体苷酸转染细胞系对照寡核苷酸转染细胞系荧光荧光荧光靶基因非靶基因初筛：荧光素酶报告基因+靶位点突变的靶基因3UTRmiRNA载体苷酸转染细胞系对照寡核苷酸转染细胞系荧光荧光靶基因突变实验： HAP2b靶位点 5 AGGCAAATCATCTTTGGCTCA 3miR169d (21nt) 3GCCGUUCAGUAGGAACCGAGU 5 突变后： 5AGGCAGCTTTGACTCG 3 kpn 红色为本身错配碱基 蓝色为突变点，突变后miRNA不切割靶基因，不影响靶基因的表达。 突变

5、点设计实例：重叠区域Kpn酶切位点53SacKpnFw1Rv1Fw2Rv2酶切：Kpn连接含突变点的靶基因3UTR区XbaKpn5553初筛： 构建microRNA前体载体、含靶位点的荧光素酶报告基因载体及对照载体转染293T或Hela细胞系（脂质体介导法）比较处理组与对照组的荧光素酶活性确定目的microRNA的靶基因突变实验：构建microRNA前体载体、含突变靶位点的荧光素酶报告基因载体及对照载体转染293T或Hela细胞系比较处理组与对照组的荧光素酶活性确定目的microRNA的靶基因，验证初筛结果。4. MicroRNA表达MicroRNA表达试验是研究MicroRNA功能的重要手段，虽然使用 microRNA前体或miRNA mimic也能达到相同效果，但价格昂贵且无法重复使用。可以使用公司研制的一种可表达成熟 microRNA的荧光素载体pRED-MIR，其携带的红色荧光可指示转染效率，筛选稳定表达目的microRNA的细