实验6微生物的计数、大小的测定和酵母菌的死活鉴别

1、实验实验6 6 微生物的计数大小的测定酵母菌微生物的计数大小的测定酵母菌的死活鉴别的死活鉴别 实实 验验 目目 的的n学习并掌握利用学习并掌握利用显微镜直接计数显微镜直接计数的基本方法的基本方法 。 n了解并掌握酵母菌的死活鉴别染色的原理和了解并掌握酵母菌的死活鉴别染色的原理和技术技术 。n了解测微尺的构造和使用，学习并掌握了解测微尺的构造和使用，学习并掌握测定测定微生物细胞大小微生物细胞大小的方法。的方法。 实实 验验 原原 理理-美兰染色美兰染色n1.1.美兰（美兰（氧化型呈蓝色，还原型呈无色氧化型呈蓝色，还原型呈无色），活的酵母菌染），活的酵母菌染色后是透明的，而死的酵母菌则被染成了蓝色

2、。色后是透明的，而死的酵母菌则被染成了蓝色。实实 验验 原原 理理-血球计数板计数血球计数板计数 n2.2.利用血球计数板，在显微镜下进行计数，换算成单位体利用血球计数板，在显微镜下进行计数，换算成单位体积内的微生物总数目。积内的微生物总数目。n由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌总菌计数法计数法。血球计数板的构造血球计数板的构造9个大格个大格16小格小格25中格中格25小格小格16中格中格无论哪一种都是无论哪一种都是400个小格个小格计数室计数室血球计数板的构造血球计数板的构造每个大方格面积为每个大方格面积为1mm2 ，高度为，高度

3、为0.1mm，所以每个计数室的体积为所以每个计数室的体积为 0.1x1=0.1mm3每个小格的体积每个小格的体积0.1/400=1/4000mm3 =1/4000,000ml血球计数板的分格计数血球计数板的分格计数1大格大格=16中格中格 =16X25小格小格=400小格小格数数25x4=100小格小格1大格大格=25中格中格 =25X16小格小格=400小格小格数数16x5=80小格小格计数方法：计数方法：通常数五个（或四个）中方格的总菌数，然后求通常数五个（或四个）中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上得每个中方格的平均值，再乘上25或或16，就得出一个大方格，就得出一个大方格

4、中的总菌数，然后再换算成中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。菌液中的总菌数。n微生物细胞大小的测量是在显微生物细胞大小的测量是在显微镜下用微镜下用目镜测微尺目镜测微尺来进行的。来进行的。 实实 验验 原原 理理-细胞大小测量细胞大小测量401040n由于测量的是放大后的图像，故目镜测微尺在由于测量的是放大后的图像，故目镜测微尺在不同放不同放大倍率大倍率下每格下每格实际实际代表的长度也随之变化，因此，需代表的长度也随之变化，因此，需用用物镜测微尺物镜测微尺来校正在不同放大倍率下目镜测微尺每来校正在不同放大倍率下目镜测微尺每格所代表的格所代表的实际长度实际长度。 n物镜测微尺是中央刻有精

5、确刻度的载玻片，一般是将物镜测微尺是中央刻有精确刻度的载玻片，一般是将1 mm1 mm等分为等分为100100格，每格长格，每格长0.01mm0.01mm，即，即10 um10 um，它，它不直接不直接用于测用于测量细胞大小，而是用于量细胞大小，而是用于校正目镜测微尺校正目镜测微尺的每格的相对长度。的每格的相对长度。n目镜测微尺每格长度目镜测微尺每格长度( (umum) )10目镜测微尺所占的格数物镜测微尺所占的格数实实 验验 材材 料料n材料：材料：1%1%酵母菌悬液（市售的干酵母粉）、酵母菌悬液（市售的干酵母粉）、0.1%0.1%的美的美蓝染色液蓝染色液 n工具：工具：显微镜、血球计数板、

6、显微镜、血球计数板、分类计数器、分类计数器、目镜测微目镜测微尺，物镜测微尺尺，物镜测微尺 、显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸 实实 验验 步骤步骤-计数计数1 1 制备菌悬液、染色制备菌悬液、染色 用吸管吸取菌悬液（用吸管吸取菌悬液（1 1滴）加入试管，用生理盐水（滴）加入试管，用生理盐水（8 8滴）进滴）进行稀释，滴加（行稀释，滴加（1 1滴）美兰染色液。滴）美兰染色液。2 2 加菌悬液样品加菌悬液样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用毛细滴管将摇匀将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用

7、的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液（注意一定不要有溢出（注意一定不要有溢出和产生气泡）和产生气泡）。3 3 显微镜计数显微镜计数 加样后静止加样后静止1 min1 min，先用低倍，先用低倍镜然后换成高倍镜，计数时，对位镜然后换成高倍镜，计数时，对位于线上酵母菌，一般只数于线上酵母菌，一般只数上方和左上方和左边线边线上的，当酵母菌芽体达到母细上的，当酵母菌芽体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个胞大小的二分之一时，可记作两个细胞。细胞。 计数一个样品计数一个样品要从两个计数室要从两个计数室中计得的值

8、来计算样品的含菌量中计得的值来计算样品的含菌量。n微生物名称微生物名称 总菌数总菌数 个个/ml4 4 清洗血球计数板清洗血球计数板 计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗切勿用硬物洗刷刷，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。5.5.计算计算 将实验结果填入作业中的表格内。将实验结果填入作业中的表格内。单细胞微生物计数单细胞微生物计数视频视频（）装目镜测微尺装目镜测微尺 （已安装好）（已安装好）（二）（二）校正目镜测微尺校正目镜测微尺 1.1.将将物镜测微尺物镜测微尺刻度刻度面朝面朝上上放在显微镜载物台上放在显微镜载物

9、台上 2. 2.先用先用低倍镜低倍镜校正再用校正再用高高倍镜倍镜进行校正，进行校正，记录记录并并计算计算在每在每种倍率下目镜测微尺每一格所代种倍率下目镜测微尺每一格所代表的长度。表的长度。 实实 验验 步骤步骤-大小测定大小测定（三）（三）酵母细胞大小的测定酵母细胞大小的测定 1 1 制备菌悬液、染色：制备菌悬液、染色：同上同上。 2 2 制片：制片： 用吸管吸取用吸管吸取1 1滴滴上述菌悬液滴加到干净的载玻片上，上述菌悬液滴加到干净的载玻片上，盖上盖玻片盖上盖玻片（注意一定不要有溢出和产生气泡）（注意一定不要有溢出和产生气泡），将多余，将多余菌液用吸水纸吸干。菌液用吸水纸吸干。 3 3 显微

10、镜下观察、测量显微镜下观察、测量 在不同倍率下测量菌体的长度和宽度，记录测定值，在不同倍率下测量菌体的长度和宽度，记录测定值，并计算出酵母的长、宽值。并计算出酵母的长、宽值。 大小测定大小测定视频视频实验注意事项实验注意事项n1.1.要正确使用显微镜，光线亮度要调的合适。要正确使用显微镜，光线亮度要调的合适。n2.2.菌液稀释倍数要合适。用前摇匀，如果浓度过大就再菌液稀释倍数要合适。用前摇匀，如果浓度过大就再稀释，如果过小再重做。稀释，如果过小再重做。n3.3.计上不计下，计左不计右计上不计下，计左不计右。出芽计一半。出芽计一半n4.4.浓度稀释标准：以浓度稀释标准：以每小方格内含有每小方格内

11、含有5-105-10个酵母细胞为个酵母细胞为宜宜，一般稀释，一般稀释1010倍即可。倍即可。 n5.5.计数室内一定不要有溢出和产生气泡。计数室内一定不要有溢出和产生气泡。n6.6.其他微生物孢子技术与酵母菌类似，基本操作一样。其他微生物孢子技术与酵母菌类似，基本操作一样。n7.7.确保血球计数板清洗干净。可以加点酒精清洗。确保血球计数板清洗干净。可以加点酒精清洗。n使用血球计数板计数时，应注意什么？使用血球计数板计数时，应注意什么？n将计数结果填入表格中。将计数结果填入表格中。n简单说明酵母菌死活染色的原理。简单说明酵母菌死活染色的原理。结果与思考题结果与思考题n填写实验表一和实验表二，完成酵母菌的大小测定。填写实验表一和实验表二，完成酵母菌的大小测定。表一 目镜测微尺校正结果目镜测微尺校正结果 接物镜接物镜倍数