GCMS内标定量法

1、安捷伦GCMS内标法定量简介（以5975为例）一、内标法基础回顾（包括外标法的概念）1. 定量响应值不同的物质，由于其物理性质，化学性质（化学结构）的不同，在气相色谱检测器（FID，TCD，FPD，ECD，MSD等）上的响应会不同。相同量的同种物质对不同检测器响应不同。相同量的不同物质对于同一种检测器响应不同。在质量选择检测器（MSD）上，物质的化学结构不同，电离电位不同，需要的电离能量不同，裂解碎片不同，裂解碎片丰度不同，这样得到的质量离子色谱图的峰面积或峰高也不同（当然总离子色谱图的峰面积也不同）。直接用响应信号定量，必然导致较大误差。故引入响应因子或校正因子。定量响应因子或校正因子对检测

2、器产生的信号加以校正，校正后的峰面积可以定量的代表物质的含量。例如图1中A, B, C三个化合物的有不同的含量和峰面积。图 1响应值S，即为某一物质（组分）在检测器所产生的信号强度（电信号，峰高，峰面积等， 本篇均采用峰面积为例， 包括下面的校正因子计算，内标法计算等），例如一定质量（m）的某一物质通过检测器在工作站或积分仪上产生峰面积为A，则可用下式表示：绝对响应值S i = Ai / mi(式中：mi -i组分的量；Si -i组分的校正因子；Ai-i组分的峰面积)绝对响应值S就是单位量物质通过检测器时产生的信号强度（电信号，峰高，峰面积等），也成为绝对灵敏度。一个化合物的绝对响应值就是该化

3、合物的含量除分析这个校正混合物时该化合物的峰面积（或峰高）的值。绝对响应值校正了检测器对不同化合物的响应能力。当校正样和未知样品在同样的条件下分析时，外标法是基本的定量方法。未知样品的结果与校正样的结果相比较从而计算出未知物的含量。外标法使用绝对响应。响应因子从校正表中得到并可储存。在分析后面的样品时，响应因子被用于计算化合物的含量。使用这种计算方法必须注意一点，即每次运行的进样量必须是一致的。或者讲每一组分的检测面积除以其已知的含量得到各自的响应值。例如图1中A化合物的绝对响应值S A=3000(假如单位为pA*sce)/100(假如单位为ng或ppm)=30B化合物的绝对响应值S B=25

4、00/80=31.25C化合物的绝对响应值S C=4000/200=20组分的面积乘以响应值得到其含量（或浓度）, 即外标法：m i = Ai S i m i = Ai /S i 外标法优点是：快速简单, 只要待测组分出峰且完全分离即可。但要求：进样量、色谱质谱分析操作条件严格不变。是属于绝对法。绝对响应值的使用也是要求进样量、色谱质谱分析操作条件严格不变。所以引入相对响应值，用于内标法的计算（进样量，操作条件没有外标法那样严格要求，是相对测定法，下面会谈到）。化合物i的绝对响应值为 S i = Ai / mi化合物s(基准物或内标物)的绝对响应值为 Ss = As / ms则化合物i对于内标

5、物s的相对响应值：S i/ s = S i /Ss = Ai ms /（As mi）(或者讲内标物的相对响应值等于1)例如图1中，假如化合物B为基准物（或内标物），则相对于B，化合物A的相对响应值是：S A/ s = 3000*80/(2500*100) = 0.96 或 S A/ s = 30/31.25 = 0.962. 定量校正因子校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位面积所代表的被测组分的量。可用下式表示：绝对质量（或重量）校正因子 fi = mi/Ai 可以导出 mi=fi Ai式中：mi -i组分的量；fi -i组分的校正因子；Ai-i组分的峰面积例如图1中A化合物的

6、绝对质量校正因子 fA = mA/AA = 100/3000 = 0.033(与组分性质、仪器灵敏度等有关，例如外标法采用绝对质量校正因子进行计算)相对质量校正因子 f i/ s = fi/fs = miAs/(msAi)例如图1中，假如化合物B为基准物（或内标物），则相对于B，化合物A的相对校正因子是：f A/ s = 2500*100/(3000*80) = 1.04响应值和校正因子的关系是互为倒数：即 S = 1/f 或 f =1/S 或Sf=1。实际上一般多采用校正因子来进行定量计算。注：安捷伦的仪器使用绝对响应因子（用RF表示）进行外标法定量，别的仪器是绝对校正因子。实际上安捷伦的R

7、F就是一般的校正因子。3. 内标法简单的讲，内标法就是在待测的样品中准确加入一定量的内标物，根据被测物和内标物的量及其在（在质谱中是质量色谱图）色谱图相应的峰面积比取出此被测定组分的含量。样品中加入内标物，利用被测物与内标物校正因子的比值不变来进行定量的。首先用被测物标准品和内标物配制标准溶液，求得定量响应因子或校正因子：S i/ s = S i /Ss = Ai ms /（As mi）或 f i/ s = fi/fs = miAs/(msAi)请参考上面的相对响应值和相对校正因子的例子。在样品中准确加入内标物后，再由它和样品的峰面积来计算： mi =（Ai /As ）*m s / (S i

8、/Ss)=（Ai /As ）*m s /S i/ s (在安捷伦上是mi=（Ai /As ）*m s * RFi/ s） 或 mi =（Ai /As ）*m s * fi/fs =（Ai /As ）*m s * f i/ s 例如，在含未知物A，C的样品中加入100ppm*的内标物B，进样后得到图2的色谱图：（注：*例如，准确称取1.0000样品，加入1000ppm（即0.1%）的内标物化合物B标准液0.1000g，即在样品中的内标含量为: 1000ppm*0.1000/1.0000 = 100ppm）图2则A化合物的含量为：miA = （AA /As ）*m s * S A/ s = 290

9、0/2400*100/0.96 = 126 (ppm)或 mi =（Ai /As ）*m s * f i/ s =2900/2400*100*1.04 = 126 (ppm)内标法的优点：进样量不严格要求. 内标的加入消除了由于进样量、仪器不稳定等因素带来的系统误差。只对欲分析的组分峰做校正内标法的缺点：每次需要准确称量内标物和样品。必须加一个组分进到样品，有可能增加面积测量误差。作为内标的化合物其化学性质和保留时间最好都应和目标化合物相似（理想状态）。但它必须能按保留时间或 m / z 值来和样品区分。同位素标记目标化合物是一个理想的内标物，它可以由其离子和目标化合物的M/Z值区别开。选择内

10、标物的标准1. 样品中不存在 2. 化学性质与样品相似 3. 与样品有相同的浓度范围 4. 不会与样品发生反应 5. 在感兴趣组分附近流出 6. 可得到分离良好的、干净利落的峰* 7. 色谱性质稳定 8. 可迅速容易得到*GC/MS对于第6项不要求。如果有条件，运用同位素标记化合物做内标物，其化学性质、色谱特性等都与目标化合物一致，因此校正精度更高。二、积分要准确定量，必须对色谱峰正确积分。质谱工作站通过两种积分方式，即RTE 积分器（RTE Integrator）和化学工作站积分器(ChemStation Integrator)。RTE 积分器对相对简单的色谱图（其中的峰很窄且已完全解析）提

11、供了一种非常快速的积分。尤其适用于 target compound analyses(目标化合物分析)。缺省参数假设待积分的数据是在整个色谱图范围内使用毛细管色谱柱色谱仪扫描到的数据的总离子流 (TIC)。如果选择适当的积分参数，则 RTE 积分器即可处理采集 (SIM) 和积分目标，如在较小的保留时间窗口中检测内标化合物。化学工作站积分器可以满足各种类型色谱图的积分，包括那些带有难于处理的基线和负峰的色谱图。通过设置积分参数（通常称作积分事件）可以控制积分过程。根据需要，在数据分析（Data Analysis）的色谱（Chromatogram）菜单的Select Integrator下面选择

12、RTE或ChemStation积分。在MS Signal Integration Parameters设置积分参数。我喜欢用ChemStation积分器。处理各种各样的峰较为方便且积分准，直观，特别峰型复杂时。但自动编辑定量时，用RTE较好。有关两种积分方法的各项参数的意义及使用方法请参考工作站中有关内容。这里就不罗嗦了。总之，在编辑定量校正表，建立校正曲线，进行内标法计算时，要设置合理的积分参数，正确积分（必要时，采用手动积分）以得良好的结果。三、建立内标定量数据库(单级校正)示例以演示数据文件 C:MSDCHEM1DATAEVALDEMO.D为例说明如何使用自动定量设置创建定量数据库。调用

13、(load)evaldemo.d质谱数据文件。并选用合适的积分参数积分。图3检索的结果为：图4这里假定四个化合物的含量如下：保留时间RT（min） 化合物 含量（ppm）5.28 十二烷（dodecane） 20 6.43 联苯 (diphenyl) （内标） 307.74 4-氯联苯 (4-chlorodiphenyl) 269.78 十六酸甲酯 (methyl palmitate) 23使用自动定量设置创建定量数据库，选择Calibate/AutoQuant Setup图5图6如果使用RTE积分，就在Use RTEINT前面打钩。如果选用ChemStation积分，则去掉。图7定量数据库全

14、局参数 (Quantitation Database Globals) 窗口用来编辑在当前的分析 中所有化合物的有关信息。在这儿可以设置定量报告、峰位置、新化合物资料等参数。这些参数设置是针对所有化合物的，但对某具体化合物可以改变设置。Calibration Title（校准标题）：如果愿意输入一个标题（可选）。这个标题将显示在每个定量报告的标题栏中。Default Multiplier（缺省的乘数）：在打印报告前，所有未知样品定量计算结果乘以这一给定的乘数。Default Sample Concentration（缺省的样品浓度）：在打印报告前对未知样品的计算结果要除以这个浓度再乘100。在

15、最后的报告中浓度单位换成 ，输入 0 值说明在报告中样品浓度用绝对值表示而不是用百分数。Reference Window / Non-Reference Window（参考峰窗口/非参考峰窗口）：用来确定在定量数据库中指定的峰是否在要处理的数据文件中，单位是 或分钟。如果设定值是5% 表示要处理的峰其保留时间必须是在定量数据库中保留时间 的 +/- 2.5%之内。若设置是5 分钟，表示将要处理的峰其保留时间是在定量数据库保留时间的 +/- 2.5 分钟之内。Reference window 用于作为时间参照（内标物）的峰。在一个完整的色谱图中，参考峰用来校正保留时间的漂移。工作站首先找到参考峰

16、，确定参考峰的漂移，在将这一漂移值用于其他峰。 non-reference window 是用于其他所有化合物。这些值范围一般小于预期的保留时间附近+/- 缺省时间值范围。Correlation Window：用于处理当前数据文件，以确定积分时找到的目标化合物和限定信号，是否为同一色谱峰（具有相同保留时间）。对扫描方式 (scan) 的数据典型值为0.05，而对 SIM 方式的数据可能需要 0.025。点OK：出现Choose Compound Name小窗口图8在Choose Compound Name选dodecane点Add加入到校正表；接着Biphenyl，内标物，点ISTD；接着Ad

17、d 4-ChloroBiphenyl及Methyl Palmitate。Add（添加） 将该化合物、其目标离子和三个限定离子添加到定量数据库中。Skip（跳过） 指示软件显示在数据文件中找到的下一个化合物。ISTD（内标） 将该化合物添加到定量数据库中，并将其标识为内标。图9图10出现”File has not been quantitated, Quantitate now?”点是（y）在New Level ID中输入1，在Compound Concentration中输入20。图11点Do Update （执行更新），可以看到随后出现Edit Compounds(编辑化合物)对话框，其中显

18、示有定量数据库中化合物的完整列表。Biphenyl（标识为内标的化合物）已经移动到了列表的顶部（尽管它在组内的Dodecane化合物之后流出），并装在一个其名称旁边带红色菱形标志的黄瓶内。带红色菱形标志的黄瓶表示其为内标。内标必须位于引用它的化合物之前，除此之外，在定量数据库中顺序并不重要。图12在上图中，可以identification下面看到化合物名称Dodecane, 浓度单位ppm。Signal to Be Used for Quantitation下面有保留时间，定量离子57.10，参比离子71.15，43.05, 85.15（这是自动选择和添加的）及其相对丰度等信息。一旦设置了数据

19、库，即可直接更改编辑化合物，这个板面是用来对化合物的每一特性进行修改。窗口的标题显示化合物在数据库中的编号位置。这里列出了用于鉴定（Identification）目标化合物所需的大部分信息。 Ret Time (Retention Time Information)：以分钟为单位输入保留时间。Extract Signals from：缺省值是在此之前于Quant Database Globals 所输入的预期保留时间范围。输入一个时间范围（以分钟计）或一个百分数，由这一时间范围来确定适用于对峰的两侧进行积分的基线位置。该时间窗口转化成相应于预期保留时间的一段时间范围（以分钟计）。时间范围的相对

20、值被存入方法中。在后面的再校正中，如果峰的保留时间偏移，该窗口会随峰移动。Quantitation Options：内标可以被指定为时间参考峰。当没有保留时间漂移时，不需要时间参考峰，只有当设定某化合物为内标时，ISTD Concentration（内标浓度）框才会显示。在该框中设定该样品中内标物的浓度。Measure response by：根据计算峰面积或峰高进行测定，这一参数最初是以全局参数设置的。Ident By.：确定如何从多个限定标准中选出最适当的。Anthracene（蒽）和 Phenanthrene（菲）适合这一情况。它们的质谱图非常一致。而保留时间只差 0.2-0.3分钟。软

21、件如何判断何者是 Anthracene，何者是 Phenanthrene呢？点Calibration，把Conc下面的浓度数字改成相应的20（dodecane不用改，相同）; 4-ChloroDiphenyl为26；Methyl Palmitate为23。内标法的横坐标为目标化合物含量与内标物含量的比值（Concentration Ratio），纵坐标为目标化合物的响应值与内标物响应值的比值(Response Ratio)。（注：外标法的标准曲线横坐标为含量，纵坐标为响应值。）点OK，图14点Edit Compounds中的“确定”，左下角会出现Finished setting up cali

22、bration table，完成。并保存方法，（否则，关掉工作站后，已建立的内标定量数据库将会丢失）。这样就完成了建立内标定量数据库(单级校正)。可以在Calibrate菜单下面的Edit Compounds查看或修改化合物的相关信息。四、手动建立内标定量数据库(单级校正)。上面是自动建立内标定量数据库(单级校正)的示意过程，下面粗略讲一下手动的方法。以ALKDEMO.D数据为例。图15图16从Calibrate / Set Up Quantitation进入图17点OK图18图19双击鼠标右键选择目标化合物输入化合物名称如果该化合物是内标，选择内标框。注意最先输入内标化合物用十字标选择目标离子和限定离子，同时击鼠标左右键单击 “Save” 保存这一信息保存最后一个化合物后单击 “Exit” 请注意! 重要! 切记! 内标位置须领先于以它为内标的其它化合物!图20图21在File has not been quantitated. Quantitate now?对话框按是（y）后面的步骤和自动建立的步骤一样。五、未知化合物的定量选择未知样的