多功能植病生防木霉的分离筛选与鉴定

1、2009 杨合同，于雪云，魏艳丽，周红姿，宋莉璐，扈进冬，李纪顺。多功能植病生防木霉的分离筛选与鉴定。山东科学，22（5）：2730多功能植病生防木霉的分离筛选与鉴定基金项目：国家“863”计划现代农业技术领域重大项目,编号2006AA10A211通讯作者：杨合同，男，博士，硕士生导师，Tel，E-mail:yanghet杨合同,于雪云,魏艳丽,周红姿,宋莉璐,扈进冬,李纪顺(山东省科学院中日友好生物技术研究中心,山东济南250014 )摘要从山东省临沂、聊城、寿光、章丘四个地区的西红柿、黄瓜大棚，韭菜、白菜菜地，大蒜、大葱种植区采取的120份土壤样品中分离获得木

2、霉244株。对峙培养发现其中对棉花立枯丝核菌具有拮抗能力的有114株；固体培养检测木霉的解磷和固氮能力，发现所有菌株都能够水解植酸钙，有74株能够水解磷酸钙，未发现能在无氮培养基上生长的木霉菌株。对抑菌圈和解磷圈最大的19株木霉在液体培养条件下检测了解磷和解钾能力，其中菌株T13-8（1.792g/mL）、T23(1.652g/mL)显示出较高的解磷能力，部分菌株在液体培养条件下不能解磷；部分菌株在液体培养下显示出解钾功能，其中菌株T47-4(20.585g/mL)显示出较高的解钾能力。上述19个菌株的形态学和ITS序列分析鉴定表明，其中9个菌株为Trichoderma longibrachi

3、atum，8个菌株为T. harzianum，另外2个菌株分别为T. virens和T. citrinoviride。关键词：多功能；木霉；解磷；植酸酶；解钾AbstractIsolation, screening and identification of multifunctional Trichoderma spp. with biocontrol capacity against plant pathogensA number of 244 Trichoderma was isolated from 120 soil samples collected from greenhouse

4、field of tomato, cucumber, Chinese chive, Chinese cabbage, garlic and green onions from Linyi , Liaocheng, Shouguang, Zhangqiu of Shandong Province. All of the 244 Trichoderma strains were dually cultured with Rhizoctonia solani which is a pathogen to cotton, and 114 isolates were shown to inhibit R

5、hizoctonia solani, of which 19 isolatesshowed better inhibitory ability than the others. All of the 244 Trichoderma strains were detected in their capability to degrade insoluble-phosphate, insoluble-potassium and fix nitrogen by solid plate culture method. The result showed that 74 isolates have ob

6、vious insoluble-phosphate solubilization ability, the above mentioned 19 isolates which were better in inhibitory ability showed also the best solubilization ability. The result also showed that no Trichoderma strain solubilize insoluble- potassium, , and there is no isolates could grow on nitrogen-

7、free medium. The 19 Trichoderma isolates with stronger inhibitory and insoluble-phosphate solubilization ability were detected in their ability to solubilize insoluble-phosphate and insoluble-potassium in liquid culture. The result indicated that some strains did not show the ability of solubilizing

8、 the insoluble-phosphate, whereas isolate T13-8 (PO43-content, 1.792 g / mL) and T23(PO43-content ,1.652g/mL) showed stronger ability in solubilizing the insoluble-phosphate; some isolates solubilized insoluble-potassium in liquid culture, in which isolate T47-4(KCl content , 20.585g/mL) was the str

9、ongest. Besides, the 19 Trichoderma isolates were detected in their phytase activity in solid culture. The result shows that 15 isolates hydrolyse phytin hydrolyzing circle, including isolate T13-8, T9-1 which were the best in phosphate solubilization and T47-4 which was the best in solubilizing pot

10、assium in liquid culture. The 19 Trichoderma isolates were identified by morphological and molecular method, and the result indicated that isolate T8-4, T9-1, T23, T25, T30-5, T31-3, T38-5, T47-4, and T35 -1 were Trichoderma Longibrachiatum, isolate T80-2, T38-6, T13-8, T44-1, T57, T62-2, T34, and T

11、17 were Trichoderm Harzianum, isolate T61-2 was Trichoderma Virens, isolate T18-1 was Trichoderma citrinoviride. Phylogenetic analysis based on ITS sequence support the identification of these 19 isolates.木霉通过多种作用机制抑制植物病原菌达到防治病害的目的，还能促进植物的生长，诱导植物产生抗病性，因此是重要的植物病害生物防治菌。除了生防功能之外，已有研究发现绿色木霉、哈茨木霉等可以溶解难溶性

12、无机磷酸盐以及金属矿物1,2,3，为植物生长提供有效的磷素和矿物营养；也有关于木霉植酸酶活性的报道4,5。本研究对从土壤中分离获得的木霉菌株进行多功能评价，包括拮抗、解磷、解钾、固氮及植酸酶活性等，然后对多功能木霉进行种类鉴定，为挖掘高效植病生防木霉资源提供依据。1材料与方法1.1 土样采集与木霉分离山东省聊城、寿光、临沂、章丘等4市有代表性的地点(西红柿大棚、黄瓜大棚、白菜种植区、韭菜种植区、大蒜种植区、葱种植区等)，采集土壤样品共120份。木霉的分离采用稀释平板法，参照参考文献6的方法进行。为防止木霉菌落过度扩张影响分离效果以及后续水解圈、抑菌圈的观察，除固氮能力测定外，其余实验均在固体培

13、养基中加入0.05%（v/v）的TritionX-100，以限制菌落的扩展速度。1.2 拮抗作用测定将待测木霉菌与立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）同步活化后，同时接种于PDA平板上对峙培养，平板直径为90mm，两个菌接种距离为50mm，72h后观察拮抗情况。1.3 解无机磷能力测定培养基：葡萄糖 10.0g；(NH4)2SO4 0.5g；NaCl 0.3g；KCl 0.3g；MgSO4·7H2O 0.3g；FeSO4·7H2O 0.03g；MnSO4·4H2O 0.03g；NaH2PO4 6.2g；琼脂 18.0g；蒸馏水补足至1000ml，PH

14、 7.07.5，115 30min灭菌备用。另配制50% CaCl2溶液，灭菌备用。每100 ml培养基中加入2.0 ml50% CaCl2溶液，摇匀，制成平板使用。接菌后观察透明水解圈判定解无机磷能力。磷钒钼黄比色法测定液体培养基中的可溶性磷含量,计为PO43-含量（g /ml）。1.4 解钾能力测定培养基：葡萄糖 5.0g；MgSO4·7H2O 0.5g；FeCl3 0.005g；Na2HPO42.0g；CaCO30.1g；钾长石 1.0g；蒸馏水定容至1000ml，PH7.07.4。四苯硼钠滴定法测定液体培养基中的可溶性钾含量，以KCl含量（g /ml）计。1.5 固氮能力测定

15、培养基：KH2PO4 0.2g；CaCO3 5.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；NaCl 0.3g；甘露醇（C6H14O6）10.0g；CaSO4·2H2O 0.1g；琼脂 18g；蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0。接菌后根据生长情况判断是否具有固氮能力。1.6 植酸酶活性测定培养基：植酸钙10.0g；葡萄糖20.0g；NH4NO3 5.0g；KCl 0.5g；MgSO4·7H2O 0.5g；FeSO4·7H2O 0.1g；MnSO4·H2O 0.01g；琼脂20.0g。接菌后观察水解圈的有无，判定植酸酶活性。1.7 木霉的种类鉴定

16、采用形态学7结合ITS序列测定比对法7，8鉴定木霉的种类，通过通用引物ITS4、ITS5扩增木霉ITS1-5.8S-ITS2段序列，产物送交上海生物工程技术服务有限公司测定序列，所得序列信息通过ITSH网站的条形码鉴定工具TrichoKEY（），进行序列比对，鉴定菌株种类。2. 结果与分析2.1 木霉的分离通过对120份来自不同地区不同作物的土壤样品进行木霉分离，共获得244株木霉菌。通过对峙培养实验，244株木霉均显示出对棉花立枯丝核菌拮抗作用，表现为重复寄生以及产生抑菌圈，其中114株的抑菌圈明显可见。按照抑菌圈大小，结合重复寄生能力观察，选择其中的19个综合拮抗能力最强的菌株进行种类的分

17、子鉴定、液体条件下解磷和解钾能力测定，这19个菌株为T8-4、T9-1、T13-8、T17、T18-1、T23、T25、T30-5、T31-3、T34、T35-1、T38-5、T38-6、T44-1、T47-4、T57、T61-2、T62-2和T80-2。2.2 木霉的解磷和固氮作用在解磷培养基上，上述具有明显抑菌作用的114株木霉中，有74株产生明显的解磷圈，所有114个菌株在固氮培养基生无明显生长现象，因此推断这些菌株都不能固氮。2.3植酸酶活性测定在平板上检测了上述114个菌株的植酸酶活性，发现所有菌株都能水解植酸钙，表明具有植酸酶活性，多数菌株的水解圈都超出了菌落覆盖范围。2.4 液体

18、培养条件下木霉的解磷与解钾作用结果见表1。可以看出，19个木霉菌株在液体培养条件下对磷酸三钙具有不同的降解能力，菌株T13-8、T23释放出的可溶性磷明显高于其他菌株，25oC培养7天后，以PO43-形式计，分别为1.792g/mL、1.652g/mL，菌液的pH也明显降低，由起始pH7.5分别降到pH5.60和pH5.79，表示解磷作用与pH有一定关系。在液体培养条件下，有8个木霉菌株检测到了解钾活性，其中菌株T47-4的解钾能力明显高于其他菌株，25oC培养7天后，释放到培养液中的可溶性钾含量达20.585g/mL（以KCl计），与报道过的细菌解钾能力（15.61g/mL55.9g/mL）

19、9相当。表1 菌液中可溶性磷、钾含量测定结果（7d，25oC）菌株编号PO43-含量（g/mL）最终pH（7d）KCl的含量(g/mL)T8-407.203.017T9-107.500T13-81.7925.600T1707.210T18-106.300T231.6525.792.406T2507.220T30-507.503.017T31-30.2557.503.781T340.3257.003.017T35-10.2556.900T38-505.732.253T38-607.400T44-107.402.635T47-40.1157.3820.585T570.1857.300T61-20.

20、2556.900T62-207.350T80-207.493.017注：表中数据为3次重复平均值。2.5 菌株种类鉴定经过形态学和ITS序列比对鉴定，19株木霉属于4个不同的木霉种类，其中菌株T8-4、T9-1、T23、T25、T30-5、T31-3、T38-5、T47-4、T35-1等9个菌株为Trichoderma longibrachiatum；菌株T80-2、T38-6、T13-8、T44-1、T57、T62-2、T34、T17等8个菌株为T. harzianum；菌株T61-2和菌株T18-1分别为T. virens和T. citrinoviride。3 讨论与结论3.1 木霉的解磷

21、作用是普遍现象，并与培养条件有关。Anusuya等1发现在液体培养条件下，T.harzianum, T. pseudokoningii和T. viride可降解磷酸钙释放出可溶性磷，培养液的pH最终表现为降低。Rudresh 等10在研究木霉菌T. viride、T. virens、T. harzianum在液体培养条件下溶解难溶性磷酸盐时，也发现了同样结果。本研究也发现多数木霉在固体和液体培养条件下具有解磷作用，因此认为解磷能力在木霉中是普遍存在的。在液体培养条件下，一些在固体基上有解磷圈的菌株并未检测到解磷活性，表明木霉的解磷活性与培养条件可能有密切关系。3.2 植酸酶在木霉中也是普遍存在

22、的。1999年，Nasi等5研究发现T. reesei同时具有植酸酶及酸性磷酸酶活性。本研究发现所有测定的114个木霉菌株都表现出植酸酶活性。植酸是土壤中磷被固定的一种形式，木霉由于产生植酸酶，能够释放被植酸所固定的磷素营养，供给植物吸收利用。3.3 某些木霉菌株具有解钾作用。目前报道的解钾微生物多为硅酸盐细菌，具有解磷能力的真菌报道相对较少，具有解钾能力的木霉菌的报道则几乎没有。本实验通过液体培养后检测，发现某些木霉菌株确实能够从钾长石中释放出可溶性钾，特别是菌株T47-4的解钾能力与已报道的解钾细菌能力相当。3.4 没有发现具有固氮能力的木霉菌株。在相关文献中至今没有发现具有固氮能力的木霉

23、菌株。本研究所测试的所有木霉菌株，在无氮固体培养基上都不能生长，表明没有固氮能力，因而没有做进一步的固氮验证研究。3.5 木霉具有种类多样性。本研究所分离的木霉，都采集自山东省传统的蔬菜生产基地。通过形态鉴定与分子生物学鉴定，表明19个菌株属于4个木霉种类，其中17个菌株为长枝木霉或哈茨木霉，这两个种类应是山东省蔬菜田的优势种类。3.6 木霉具有多功能性。作为植病生防菌，木霉是最重要的成员之一，也是迄今商品化次数最多的。木霉的抗菌特性是作为生防菌的首要条件，但考虑到商业化应用，也应当考虑到其他功能，例如肥料功能，或者刺激植物生长的能力。在这些方面，已经有人注意，例如1999年，Altomare

24、等2发现, T.harzianum菌株T22具有溶解可溶性或微溶性矿物质的能力, 通过螯合或降解作用来溶解金属氧化物, 促进植物对矿物质的吸收, 提高植物的生长量； 2001年，Yedidia等3发现木霉菌促进微量元素的可利用性，并促进黄瓜的生长；我们11以前的研究也发现木霉能够产生赤霉素、吲哚乙酸、细胞分裂素等植物生长调节物质。本研究发现，自然存在的木霉，既能够拮植物抗病原菌，又能够解磷（无机磷和有机磷）、解钾，而且同一个菌株即具有上述三种功能，表明木霉是多功能性的，完全有可能从野生型木霉菌株中通过常规筛选，找到优良的同时具有抗病促生作用的多功能菌株，满足产品开发要求。参考文献1. Anus

25、uya D, Jayarajan R, Solubilization of phosporus by Trichoderma virideJ, Current Science, 1998, 74:464-465.2. Altomare C., Norvell W. A., Bjokman T. et al. Solubilization of phosphates and micronutrients by the plant growth promoting and biocontrol fungus Trichoderma harzianum Rifai J,Environ Microbi

26、ol, 1999, 65: 2926-2933.3. Yedidia I, Srivastva A. K., Kapulnik Y. Effect of Trichoderma harzianum on microlement concentrations and increased growth of cucumber plants J, Plant and Soil, 2001, 235:235-242.4. 杨燕凌,沙莉,方金铜。微生物植酸酶的研究与应用J。武夷科学，2007, 23：191-1955. Nasi. M., Piironen J., Partanen K. Efficacy of Trichoderma reesei phytase and acid phosphatase activity ratios in phytate phosphorus degradation in vitro and in pigs fed maize-soybean meal or barley-soybean meal diets J,Animal Feed Science and Technology,1999,77,125-137.6. Yang He-tong，Maarten Ryder，Tang