流体动力色谱法和障碍色谱法及其应用

1、流体动力色谱法和障碍色谱法及其应用         11-04-23 15:04:00     作者：李建军 刘鹏 耿信笃    编辑：studa20【摘要】  介绍了流体动力色谱（HDC）和障碍色谱（SC）及其在生物、化工分离中的研究进展，着重于它们的分离原理、理论发展及二者之间的联系与转化，引用52篇文献。 【关键词】  动力学液相色谱, 流体动力色谱, 障碍色谱，DNA分离，评述Abstract  H

2、ydrodynamic chromatography(HDC) and slalom chromatography(SC) called as dynamic liquid chromatography(DLC) were introduced and reviewed, mainly for the recent development of separation principle, theoretical model, and applications. Fifty two references were cited.Keywords  Dynamic liquid chrom

3、atography, hydrodynamic chromatography, slalom chromatography, deoxyribonucleic acid separation, review1  引 言    随着生命科学研究的不断深入，液相色谱法(LC)在分离纯化多肽及蛋白质方面的应用也得到了迅速地发展，尽可能提高其分离度已成为LC研究中最重要的课题之一1,2。多年来，研究溶质组分的色谱保留行为基本上依据热力学因素，即根据各组分在固定相和流动相中的分配系数的差异实现对组分的分离，并且假定组分在该二相间的分配或吸附平衡是瞬时完成的。然而，

4、早在1956年，荷兰学者Van Deemter便提出了色谱过程的动力学理论速率理论3。他将色谱过程视为一个动态的非平衡过程，研究分离过程中的动力学因素对峰展宽的影响。此后，Giddings等4在Van Deemter方程的基础上，提出了LC的速率方程，即Giddings方程，他们认为溶质在流动相和固定相转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际上组分传质速度是有限的，说明分离中总是存在着动力学的非平衡过程。液相色谱的分类是依据溶质与固定相之间的作用特征，如电荷作用的离子交换色谱，疏水相互作用的疏水相互作用色谱和反相色谱，亲合作用的亲合色谱及分子大小的尺寸排阻色谱等。本文介绍的流体动力色谱（hydrod

5、ynamic chromatography, HDC）和障碍色谱（slalom chromatography, SC），其溶质均与固定相之间的作用特征无关，或关系甚小，而主要与流动相的流动特征有关，或是基于动力学因素发展起来的两种新的色谱方法，二者通称为动力学液相色谱法。目前, 它们已经在测定和分离聚合物、多肽、DNA和生物大分子方面广泛应用。文献5从与SEC 比较的角度简要地介绍了HDC和SC的分离原理及二者之间的不同点。本文详细并系统地说明了HDC和SC的分离原理、模型、理论发展、仪器设备和最新应用，并探讨了HDC与SC之间的联系及相互转化。    

6、 2  流体动力色谱（HDC）    HDC是Small等20世纪70 年代初就已开发出的一种可同时测定聚合物或胶体乳胶粒的直径及其分布的方法68。他们采用了无孔刚性固体颗粒填充色谱柱，待分离乳液在高压下通过色谱柱时，由于不同大小的溶质所受到的水动力效应的不同，其乳液在流动相中的移动速度也不同，从而实现了聚合物或胶体悬浮液的分离。Mori 等9进一步发展和完善了HDC, 并将其应用到某些天然高分子的分离。后来人们发现在一根直径为几百微米的毛细管中同样也可实现不同粒径混合物的分离10。这种采用毛细管，而不是填充柱作为分离柱的分离方法拓宽了HDC的应用范围，

7、这在理论研究和实际应用上都有着非常重要的意义。用内径小于10 m 的毛细管（称其为微毛细管）, 其分离机理与内径大于10 m 的毛细管略有不同，文献1114对微毛细管HDC进行了详细的理论探讨和应用研究。2.1 HDC的原理2.1.1 HDC柱 毛细管HDC 和填充柱HDC所需色谱装置大体相同。二者的区别在于毛细管HDC采用管径不同的毛细管作为分离色谱柱，而填充柱HDC 则使用无孔刚性固体颗粒填充的色谱柱。相对于毛细管HDC, 填充柱HDC 的设备简单，操作简便，尤其是检测手段的简化，通常使用紫外检测器便能满足要求。而毛细管HDC受到进样量和检测浓度的限制，要求检测器较为灵敏，通常使

8、用高灵敏度紫外检测器或其它手段，如电位分析、激光激发荧光法及激光光散射法等15。2.1.2 HDC分离模型 尽管HDC包括了前述的两种主要模式，毛细管HDC和填充柱HDC，而大部分有关HDC的理论都以前者为主16,17，由于可将填充HDC 颗粒间的间隙视为毛细管体系，故填充HDC与毛细管HDC具有相同的分离模型。HDC的分离机理为：当流动相从填料颗粒间经过时，由于水动力效应的存在使其流型为层流抛物面型，溶质在这种情况下的分离主要是借助于靠近填料颗粒表面的低流速区域所产生的排斥效应，大的溶质分子由于受到的排斥效应大于小溶质分子，更容易远离填料颗粒表面而进入高流速区域，这样大分子溶质的移

9、动速度大于小分子溶质，从而先于小分子被洗脱出来。有多种模型描述了溶质在HDC中的保留行为，最简单的仅考虑了几何学效应，而常用的模型是DiMarzio 和Guttman16,18及Brenner和Gaydos17依据几何学原理而提出的保留时间和溶质大小的关系。如图1所示，溶质分子在毛细管内的迁移可用式（1）来表示：R=(1+BC)1（1）式中，R=tm/t0为溶质的保留值与无限小的标记物的保留值之比，也称之为相对保留值；=de/dpor, de为溶质的有效直径，dpor 是毛细管的直径。B和C均为与几何学有关的常数；C值介于0.55之间，在填充柱里C值介于2.7至2.8之间。 

10、0;  从式（1）看出，粒径不同的颗粒的相对停留时间是不同的，这样具有不同大小颗粒的溶质便可用HDC法进行分离。由于大分子先于小分子被洗脱出来，因此，虽然它所用分离原理与尺寸排阻色谱（SEC）不同，但其洗脱顺序却与SEC相同。    需要指出的是，在式（1）的推导过程中将被测粒子假定为刚性的不旋转微球，而实际上对于流动体系中的粒子来说，其上下所受的力是不平衡的，在力矩的作用下将发生旋转, 这种转动又会影响其流动速度。这个现象最早由DiMarzio和Brenner等论及。2.2 HDC的发展和应用    HDC要求溶质分子的大

11、小与流经管道直径的比值不应小于0.01，一般介于0.010.35之间2。在HDC提出的初期，使用小孔径的毛细管(50500 m i.d.)，或者使用填充1020 m填料的填充柱，其内部管道相对较大，因此它们仅局限于分析一些较大的溶质，如纤维和固体颗粒2，。一般来说, 采用小内径的毛细管，或非常小的粒径均匀的微球作为填料时可显著提高HDC 柱的柱效，可使用内径更小的（15 m）的毛细管和更小颗粒的填料（11.5 m），23来提高HDC的分离度。如Stegeman等,利用粒径范围在1.42.7 m 单分散SiO2 微球为填料，较好地分离了聚苯乙烯颗粒、胶体SiO2 颗粒和蛋白质等。考虑到HDC 的

12、分离机理在SEC中同样存在，故可将HDC与SEC结合, 从而拓宽所分离溶质分子量的范围。Cheng等2利用粒径不同的玻璃微球为填料在填充柱中分离聚苯乙烯颗粒, 以此讨论了SEC和填充柱HDC之间的异同。Stegeman 等利用填充有多孔的SiO2颗粒和苯乙烯与二乙烯基苯交联共聚物颗粒的填充柱分离了聚苯乙烯颗粒，认为小分子量聚苯乙烯颗粒主要按SEC 机理分离，而高分子量聚苯乙烯颗粒则按HDC 机理分离，分子量范围可扩充至102107之间。这样HDC的应用范围覆盖了SEC的范围1,。    分析分离仪器的微型化是当今科学仪器发展的趋势，可以减小试剂消耗、提高分离分析效

13、率和缩短分析时间。但是，使用小内径的毛细管会增加检测的难度1,1。为解决这个问题， Chmela 等,3设计了芯片HDC装置，采用荧光检测，在3 min内完成了荧光纳米级微球的分离与检测。由于硅微技术可以提供准确的几何形状，硬度高，且耐有机溶剂和高温腐蚀，所以该体系使用1 m×1000 m(深和宽)的硅刻槽作为分离管路，连接体积为300 pL的进样器，并采用压力驱动流动相。该体系可提供十万个理论塔板数，已用来分离聚合物和生物大分子颗粒，真正达到了芯片实验室的程度，并定性地验证了HDC理论。然而他们认为这种保留和扩散的模型需要从定量的角度上加以描述和改进。Blom等3也设计了熔融硅胶板

14、状的紫外检测芯片HDC装置，使用69 mm ×0.5 mm×1 m的分离管道连接150 pL进样器，其检测池的深和宽皆为30 m，用此装置分离了粒径为26155 nm的荧光分子和聚苯乙烯混合物，并描述了平面HDC保留与扩散行为以及壁效应对扩散的影响。上述两种芯片装置中的检测器与分离管路结合在一起，因此两者之间无死体积，这样大大减小了溶质峰的柱外扩散，有效地提高了分离效率。3  障碍色谱（SC）3.1 SC柱及分理原理3.1.1 SC柱 SC所用仪器设备与常规HPLC所用设备基本相同。由于溶质在SC中的分离与填料的孔径和化学性质无关，所以SC对色谱柱的要求

15、相对简单。已报道有使用C1反相柱，凝胶渗透色谱柱和3,3和离子交换色谱柱5，流动相与SEC所用流动相相同，有时为了消除色谱柱的微弱的疏水作用，加入了5%20%的有机溶剂，如乙睛。3.1.2 SC分离模型 SC是在1988年依据动力学原理提出的一种新颖的方法，用于分离分子量相对较大（>5 kbp）的DNA分子,37。一般认为，SC的分理机理是：DNA分子的分离主要依靠流速和填料颗粒的大小而非填料的孔径和化学性质3。填料的作用仅被用来形成填料之间的网状空隙，当DNA分子进入色谱柱，它需要不断绕过填料颗粒的球型障碍，就像障碍滑雪一样，DNA分子越大或填料颗粒越小，则DNA分子穿出色谱柱也越困难。这样大的DNA分子在填料颗粒间的移动速度小于小的DNA分子，最终在小分子之后被洗脱出来3。 Guillaume等4对SC的机理进行了研究，提出了DNA分子在SC里分离的模型，并对该模型进行的验证4。该模型给出了相对保留值与流动相流速的关系：(ekv+kv）（）