泽泻防治泌尿系结石有效部位工艺及药理学研究

1、华中科技大学硕士学位论文泽泻防治泌尿系结石有效部位工艺及药理学研究姓名：刘妙娜申请学位级别：硕士专业：生药学指导教师：尹春萍20080501独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复

2、印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密 ，在_年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在以上方框内打“” ）学位论文作者签名： 指导教师签名：日期： 年 月 日 日期： 年 月 日华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文中文摘要目的：在前期国家自然科学基金（No: 39970891）研究的基础上，初步确定泽泻防治泌尿系结石有效部位为提取物中的总三萜成分。本文应用大孔吸附树脂分离纯化泽泻药材中的三萜类化学成分，使其含量达到50%以上，其标示量成分23-乙

3、酰泽泻醇B含量达到1.29%以上，并通过药效学实验进一步确证该有效部位为防治泌尿系结石的活性部位。方法与结果：1、建立了泽泻有效部位中总三萜的含量测定方法。以药材中含量最高的三萜类23-乙酰泽泻醇B为对照品，用5%香草醛-冰醋酸溶液，高氯酸显色，在554nm波长处测定样品吸收度。实验表明23-乙酰泽泻醇B在23.80142.8ug线性范围内，线性关系良好，其回归方程为Y=0.0055x-0.0512，r=0.9996。该方法操作简便，结果稳定，重现性好，可作为泽泻药材质量监控的有效手段。2、建立了泽泻有效部位中23-乙酰泽泻醇B的HPLC-ELSD含量测定方法。以23-乙酰泽泻醇B为对照品，应

4、用HPLC-ELSD对泽泻有效部位中23-乙酰泽泻醇B的含量测定进行了方法学考察。结果表明在23-乙酰泽泻醇B进样量在0.1384ug0.6920ug之间时线性关系良好，其回归方程为：Y=494467X-4426.9,r=0.9999。加样回收率为99.97%,RSD为2.680%。精密度、重复性、稳定性实验也均符合要求。3、建立了泽泻防治泌尿系结石有效部位的制备方法。首先优化了泽泻有效部位的提取工艺，以23-乙酰泽泻醇B含量为指标对提取工艺进行优化，经正交实验考察，确定最佳提取工艺为：70%乙醇、用量为10倍量、提取3次、每次1.5h。 继而对大孔吸附树脂分离富集有效部位的工艺进行了筛选及优

5、化。泽泻浸膏用一定量50%乙醇溶解后，上样于D型大孔吸附树脂，充分吸附后，再用一定量 1华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文蒸馏水，30%乙醇，90%乙醇依次洗脱，收集90%乙醇洗脱液，蒸干溶剂，干燥，即为所得。以23-乙酰泽泻醇B为对照品计算，富集产物中总三萜类含量可达50%以上，23-乙酰泽泻醇B含量可达1.290%以上。实验表明：D型大孔吸附树脂适合分离纯化泽泻中极性较小的三萜类成分。4、探讨中药泽泻总三萜有效部位在体外对草酸钙结晶形成的影响，并初步确定其抑制草酸钙结石形成的有效部位。应用种晶技术检测泽泻不同浓度的总三萜提取物在体外对一水草酸钙晶体生长指数（I.I）。结果表明泽

6、泻总三萜浸膏高、低剂量组的草酸钙晶体生长抑制指数高达87.75%。中药泽泻总三萜提取物能明显抑制草酸钙晶体的生长，是泽泻抑制草酸钙结石形成的有效部位，对该部位的有效化学活性成分有待于进一步的研究。【关键词】：泽泻；23-乙酰泽泻醇B；总三萜；含量测定；分光光度法；大孔吸附树脂；草酸钙晶体；种晶技术2华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文AbstractObjective: Based on the early pharmacology experiments. Total triterpenes was identified to be effective fractions of A

7、lisma orientalis preliminary.Macroporous resin was used in separation and purification of the total triterpenes of Alisma orientalis, the content of total triterpenes in the effective fractions reached More than 50 percent. And Alisol B 23-acetate was chose as evaluation index and its amount reached

8、 1.29 percent and above.And the Anti-urinary tract stones effect of effective fractions was studied in vitro.Methods and results: A new method was established for the determination of total triterpenes from the effective fractions of Alisma orientalis. Total triterpenes was measured by spectrophotom

9、eter with 5% vanillin-glacial acetic acid solution and perchloric acid as color-developing agent and detected at 554 nm wavelength. The calibration curve was linear (r=0.9996) in the range of 23.8142.8ug and the curve was Y=0.0055x-0.0512.The experiment showed that the spectrophotometer was suitable

10、 for the determination of total triterpenes from Alisma orientalis.A new method was established for the determination of Alisol B 23-acetate from the effective fractions of Alisma orientalis. The content of Alisol B 23-acetate was measured by HPLC-ELSD. The experiment showed that the calibration cur

11、ve was linear in the range of 0.1384ug0.6920ug and the curve was Y=494467X-4426.9,r=0.9999. The results of the experiments of accuracy、reproducibility and stability were good.The observation of the extracted term of the effective fractions of Alisma orientalis 3华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文with the amount

12、 of Alisol B 23-acetate as evaluation index gave the result that the best extracted term was that Alisma orientalis was extracted by 70% alcohol for three times, each time last for 1.5h. The volume of alcohol was ten times of the medicinal substances each time. In several kinds of macro absorption r

13、esins, conclusion was reached that the A resin was the best and the best technology term was that First, the extractum of Alisma orientalis was dissolved by a certain amount of 50% ethanol solution and then the sample was fully adsorpted by the HPD-100 macro absorption resin; Second, a certain amoun

14、t of distilled water, 30% ethanol, 90% ethanol was used to elute the sample in order. Then, the eluting of 90% ethanol solution was collected. Solvent was evaporated. Dried and then the residues was collected. Alisol B 23-acetate was used as an evaluation index and gave the result that the concentra

15、tion of total triterpenes reached up to 50 percent, and the concentration of Alisol B 23-acetate also reached up to 1.29 percent. Experiments showed that: HPD-100 macro resin was suitable for isolation and purification of triterpenoid compounds which polarity was weak in Alisma orientalis.To study t

16、he effect of total triterpenes of Alisma Orientalis on calcium oxalate crystal formation in vitro and to identify the effective constituents. We detected the growth index (I.I) of calcium oxalate crystal by a seeded crystallization technique. Both the high and low dose of total triterpenes can reduc

17、e the growth index of crystallization reach 87.75%. The total triterpenes of Alisma Orientalis seems to inhibit significantly calcium oxalate crystal formation in vitro and to be the effective constituent of Alisma Orientalis.Key words: Alisma Orientalis(Sam.)Juzep.; Alisol B 23-acetate; Total trite

18、rpenes; Content determination; Spectrophotometer; Macro absorption resin; Calcium oxalate crystal; Seeded crystallization technique4华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文前 言泌尿系结石，是威胁人类健康的常见疾病之一，其中绝大多数是草酸钙结石。随着体外冲击波碎石术等现代高科技技术的临床应用，泌尿系结石的治疗已取得较大的进步，但泌尿系结石被摘除或排出后复发率很高，达6080。研究发现，目前治疗泌尿系结石及预防其复发的药物，如枸橼酸钾、磷酸纤维素钠、正磷酸盐、

19、噻嗪类药物等，临床疗效不满意，而且副作用较大。泽泻为泽泻科植物泽泻Alisma orientalis (Sam.) Juzep.的干燥块茎。性寒,味甘、淡。入肾、膀胱经。味甘、淡,可渗湿,性寒能泻肾及膀胱之热, 为常用的利水、渗热、泻热药物。 临床上常用于小便不利、水肿胀满、泄泻尿少、痰饮眩晕、热淋涩痛、高血脂症等的治疗。泽泻可与多种中草药配伍组成多种方剂，如金龙排石汤、猪苓汤、五苓散等，用于泌尿系结石的治疗。但是对于泽泻单味药材应用于泌尿系结石方面治疗的研究报道较少。近年来，对泽泻的化学成分研究表明：泽泻中含有系列三萜类泽泻醇A、B、C , 24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、24-乙酰

20、泽泻醇C等和系列倍半萜类(orientalol A、B、C、D 等) 以及挥发油、生物碱、天门冬素、脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸)、树脂、蛋白质、淀粉等成分。其中三萜类化合物泽泻醇A、B、C 和24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、24-乙酰泽泻醇C具有利尿、降血脂、抗脂肪肝及保肝作用，为泽泻的主要活性成分。此后,各国学者又从不同产地、不同加工方法的泽泻原料中分离得到了30多个三萜类化合物,其结构多为原萜烷型(Protostane) 四环三萜。从生物途径来归纳,它们均由新鲜植物中含量很高的23-乙酰泽泻醇B (Alisol B 23-acetate) 衍生而来。泽泻中三萜醇酮的结构如

21、下：5华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文在日本，自1980 年八竹和粟田等报告猪苓汤具有治疗泌尿系结石的作用以来，猪苓汤就成为了临床预防和治疗尿石症的常用药物之一。此后，陆续有学者对猪苓汤治疗尿石症的作用机制进行了研究。1985 年小川等发现猪苓汤可降低尿液中草酸排泄量和肾组织草酸含量而抑制大白鼠实验性肾结石的形成。Utsunmiya 等对组成猪苓汤的单味中药进行逐一筛选试验，发现泽泻水提取液在浓度为5mg / ml时，体外能明显抑制草酸钙结晶的生长和聚集，聚集抑制指数（Ia）大于80%，生长抑制指数（Ig）大于90%。Kawamura 等研究表明，在稀释的尿液中，泽泻水提取物浓度

22、在10mg / ml 时有强烈的抑制草酸钙生长6华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文和聚集作用，而在未稀释的亚稳尿液中，泽泻水提取物浓度在0.1 1.0mg / ml 时，即有抑制作用，同时发现泽泻水提取物中不含有萄胺聚糖类物质，但是其中所含分子量大于10，000 的大分子物质有强烈的抑制草酸钙晶体生长和聚集作用。Yamaguchi等发现泽泻水提取液在大鼠体内能明显降低肾组织钙含量和抑制大鼠实验性肾结石的形成。另外，研究还发现泽泻对草酸和钙的代谢没有影响，推测其主要在结石形成过程中阻止草酸钙结晶生长和聚集。在国家自然科学基金资助下（No: 39970891），尹春萍等对泽泻防治泌尿系

23、结石的有效部位进行了筛选，发现泽泻用70%乙醇提取的提取液经乙酸乙酯萃取后所得到的乙酸乙酯部位在体外实验中能明显抑制尿草酸钙结晶的生长和聚集，体内能明显降低肾钙含量和减少肾小管内草酸钙结晶形成。同时，曹正国等应用现代植化方法泽泻乙酸乙酯部位进行进一步分离提取，得到3种化学成分，这3种化学成分在体外对尿草酸钙结石形成有明显的抑制作用，其中，化学成分对草酸钙晶体生长抑制作用最强，且该抑制作用在一定范围内呈时间、剂量依赖性,其结构经初步鉴定主要为类化合物。综合大量文献，我们得出泽泻萜类化学成分可能是泽泻抑制尿草酸钙结石形成的活性部位的结论。该部位的有效活性成分有待于更深入的研究。7华 中 科 技 大

24、 学 硕 士 学 位 论 文第一部分 泽泻实验研究第一章 泽泻有效部位总三萜的含量测定1.1 仪器与试药仪 器：紫外-可见光分光光度计（UV-cary2000）电子分析天平（精确至十万分之一：AG285，METTLER TOLEDO） RE-52A型旋转蒸发仪（巩义市英峪予华仪器厂）SHZ-D（）循环水真空泵（上海东玺制冷仪器设备有限公司） AS2060B型超声波清洗仪（Automatic Science Instrument Co. Ltd） DZF-6020型真空干燥箱（上海索谱仪器有限公司）HH-4型恒温水浴锅（江苏省金坛市阳光仪器厂）对照品：23-乙酰泽泻醇B（由南京中医药大学提供1）

25、。经HPLC峰面积归一法确认其纯度大于98%，符合含量测定要求。药 材：泽泻（购于武汉市汉口国药有限公司，安徽亳州产。经华中科技大学同济医学院药学院生药教研室尹春萍教授鉴定为泽泻科植物泽泻(Alisma orientalis (Sam.) Juzep .)的干燥块茎）；试 剂：甲醇，乙醇，乙酸乙酯，高氯酸，冰醋酸，香草醛等试剂为分析纯。乙腈为色谱纯。1.2 对照品和供试品溶液的制备1.2.1 对照品溶液的制备23-乙酰泽泻醇B为从泽泻中分离得到的化合物，该成分在泽泻药材中含量较高且较稳定，符合对照品要求。本对照品经峰面积归一法纯度测定表明：其纯度大于98%，符合含量测定要求。8华 中 科 技

26、大 学 硕 士 学 位 论 文 图 1.1-1 对照品 HPLC 归一化法纯度测定色谱图 精密称取 23-乙酰泽泻醇 B 对照品 5.950mg， 溶于无水乙醇中定容至 50ml， 得对照品溶液，浓度为 0.1190mg/ml，摇匀，备用。 1.2.2 供试品溶液的制备 称取泽泻粗粉 20g,加入 10 倍量 70%的乙醇，回流提取三次，每次为 1.5h。 过滤，合并滤液，回收溶剂至浸膏状，加入 100ml 水分散，分别用 100ml 水饱 和的乙酸乙酯萃取 3 次，合并萃取液，回收溶剂得浸膏，干燥。将浸膏用 300ml50%乙醇溶解。备用，作为供试品。 1.3 1.3.1 方法学认证实验 测

27、定波长的选择 分别取一定量的 23-乙酰泽泻醇 B 对照品溶液和供试品溶液加显色剂后 （同 标准曲线项下方法） ，于紫外-可见光分光光度计上扫描，两者均在 550nm 附近 有一吸收峰且空白对照无干扰，综合两者图谱，确定 554nm 为测定波长2-5。 9 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文图1.3-1 对照品溶液全波长扫描图谱 图1.3-2 供试品溶液全波长扫描图谱1.3.2 稳定性试验和测定波长的确定取对照品溶液和供试品溶液分别为0.2ml，0.1ml。按标准曲线项下方法，依法显色后，分别在0120min内测定，对照品溶液和供试品溶液均在1530min内稳定，RSD分别为0.1

28、8%，0.06%；30min后稳定性开始下降。表明：该方法测定需在显色后1530min内完成。另取两份对照品和供试品溶液，依法显色后在1530min内重新扫描波长，确定波长依然为554nm。1.3.3 显色剂使用条件的选择1.3.3.1 5%香草醛-冰醋酸用量考察分别精密吸取23-乙酰泽泻醇B对照品溶液和供试品溶液各5份于具塞试管中，每份分别为0.2ml,0.1ml。水浴蒸干后各加5%香草醛-冰醋酸0.1，0.2，0.3，0.4，0.5ml，然后各加高氯酸0.8ml，于60水浴加热中15min。取出置冰水中冷却后，加乙酸乙酯5ml,摇匀室温放置10min后，在554nm处测定吸收值，结果见表1

29、.3-1。表1.3-1 不同香草醛用量结果 5%香-冰V/ml对照品Ab供试品Ab 结果显示：0.3ml5%香草醛-冰醋酸为最佳用量。10华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1.3.3.2 高氯酸用量考察分别精密吸取23-乙酰泽泻醇B对照品溶液和供试品溶液各5份于具塞试管中，每份分别为0.2ml,0.1ml。水浴蒸干后各加5%香草醛-冰醋酸0.3ml，再分别加高氯酸0.6，0.8，1.0，1.2，1.4ml，于60水浴加热中15min。取出置冰水中冷却后，加乙酸乙酯5ml,摇匀室温放置10min后，在554nm处测定吸收值，结果见表1.3-2。表1.3-2 不同高氯酸用量结果 高氯

30、酸V/ml对照品Ab供试品Ab 结果显示：1.0ml高氯酸为最佳用量。1.3.3.3 水浴温度考察分别精密吸取23-乙酰泽泻醇B对照品溶液和供试品溶液各5份于具塞试管中，每份分别为0.2ml,0.1ml。同上法分别在50，60，70，80，90测定吸光度值，结果见表1.3-3。表1.3-3 不同水浴温度考察结果水浴温度T/对照品Ab供试品Ab 结果显示：随温度升高，吸收值增加且变得不稳定，且超过60空白显色剂开始变色，故本文选择水浴温度为60。1.3.3.4 水浴时间的选择分别精密吸取23-乙酰泽泻醇B对照品溶液和供试品溶液各5份于具塞试管中，每份分别为0.2ml,0.1ml。同上法分别在水浴

31、10，15，20，25，30min条件下测定吸光度值，结果见表1.3-4。11华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 表1.3-4 不同水浴时间考察结果 水浴时间t/min对照品Ab供试品Ab 10 15 20 25 结果表明，水浴时间20min为最佳。1.3.3.5 结论：应用紫外-可见光分光光度计测定泽泻三萜类化合物含量时，优选的显色条件为：加入0.3ml5%香草醛-冰醋酸溶液和1.0ml高氯酸，水浴温度为 60，水浴时间为20min。1.3.4 标准曲线的制备精密吸取上述对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml，分别置于具塞试管中，水浴挥去溶剂，冷却，准确加入

32、0.3ml5%香草醛-冰醋酸溶液和1.0ml高氯酸，混匀，密塞。置60恒温水浴中加热20min，取出，冰水浴冷却，加乙酸乙酯5ml，摇匀，室温放置10min后，在554nm处测定吸光度，以试剂为空白。以吸光度为纵坐标，23-乙酰泽泻醇B对照品微克数为横坐标作标准曲线，回归方程为：Y=0.0055x-0.0512，r=0.9996，线性范围为23.8142.8ug。表1.3-5 标准曲线 序号 加入对照品量(ug) 吸光度（Ab）-0.0512 0.9996 56119 142.8 0.0055 0.5971 0.752212华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文1.3.5 精密度考察精

33、密吸取同一对照品溶液5份于具塞试管中，体积分别为0.1ml。显色后依法测定，RSD为0.4860%。见表1.3-6。表1.3-6 精密度考察实验 序号 对照品Ab 对照品Ab平均值RSD(%)0.486 0.10591.3.6 重现性试验取同一泽泻供试药材各5份，按供试品溶液的制备项下操作。并依法显色后测定吸光度值，RSD为1.03%。13华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文表1.3-7 重现性考察实验序号供试品Ab供试品Ab平均值RSD(%)1.031.14221.3.7 回收率测定精密吸泽泻粗粉30g各7份，1份未加入对照品溶液，作为空白对照，其余6份分别加入对照品溶液（0.11

34、90mg/ml）1.0ml，按供试品制备项下操作。依法测定，结果见表1.3-8。表1.3-8 回收率试验结果 （n=6）加入对照测得含总三萜的回收率平均回收RSD品的量/ug 量/ug （%）率（%） （%）119.0 97.03119.0119.0119.0其中,M0为未加对照品的样品中测得的总三萜的质量编号吸光度Ab空白 1 2 3 4 5 6 0.5709 1.200 1.216 1.208 1.195 1.213 1.1931.231%14华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文第二章 泽泻有效部位中23-乙酰泽泻醇B的含量测定2.1 实验仪器及试药仪 器：紫外-可见光分光光度计

35、（UV-cary2000）电子分析天平（精确至十万分之一：AG285，METTLER TOLEDO） RE-52A型旋转蒸发仪（巩义市英峪予华仪器厂）SHZ-D（）循环水真空泵（上海东玺制冷仪器设备有限公司） AS2060B型超声波清洗仪（Automatic Science Instrument Co. Ltd） DZF-6020型真空干燥箱（上海索谱仪器有限公司）HH-4型恒温水浴锅（江苏省金坛市阳光仪器厂）高效液相色谱仪（日本日立公司）；Alltech ELSD2000蒸发光散射检测器；色谱柱为HypersilODS25umC18柱（250mm*4.6mm）；25ul进样器,四元泵，T20

36、00色谱工作站；一次性滤器（0.45um）；水为纯净水（娃哈哈）。对照品：23-乙酰泽泻醇B（由南京中医药大学提供）。经HPLC峰面积归一法确认其纯度大于98%，符合含量测定要求。药 材：泽泻（购于武汉市汉口国药有限公司，安徽亳州产。经华中科技大学同济医学院药学院生药教研室尹春萍教授鉴定为泽泻科植物泽泻(Alisma orientalis (Sam.) Juzep .)的干燥块茎）；试 剂：甲醇，乙醇，乙酸乙酯，高氯酸，冰醋酸，香草醛等试剂为分析纯。乙腈为色谱纯。2.2 对照品和供试品溶液的制备2.2.1 对照品溶液的制备精密称取于60干燥至恒重的对照品23-乙酰泽泻醇B3.460 mg，置5

37、ml 15华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 容量瓶中，加乙腈定容至刻度，浓度为0.6920mg/ml。精密吸取此溶液20ul，40ul，60ul，80ul，100ul于2ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，过0.45um滤膜，分别配成0.00692mg/ml，0.01384mg/ml，0.02076mg/ml，0.02768mg/ml，0.0346mg/ml的系列对照品溶液。2.2.3 供试品溶液的制备将泽泻粉碎成粗粉, 称取20g,加入10倍量70%的乙醇，回流提取三次，每次为1.5h。提取完毕，过滤，合并滤液，取部分用微孔滤膜(0.45um ) 滤过，注入高效液相色谱仪，测定

38、泽泻醇B23-乙酸酯的含量。余下部分挥干溶剂，干燥，称重，计算泽泻醇B23-乙酸酯占浸膏的比例。2.3 色谱条件色谱柱：HypersilODS25umC18色谱柱（250mm*4.6mm）；流动相：乙腈-水（92：08）；流 速：1.00ml/min；漂移管T：82；N2流速：2.0L/min；实验证明在上述色谱条件下，供试品溶液中23-乙酰泽泻醇B能与其他色谱峰得到很好分离，见图2.3-1。图2.3-1 供试品溶液的HPLC图谱16华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2.4 方法学认证实验2.4.1 流动相、流速、漂移管温度及N2流速的选择2.4.1.1 流速的选择流动相、流速、

39、漂移管温度及N2流速均对流速有很大的影响，乙腈比例越大，流速越快，漂移管温度越高，N2流速越大，出峰越快，但是同时对柱子造成的压力也相应加大，影响柱子寿命；而且出峰过快，容易造成部分峰重叠，不能反映样品成分的真实情况，影响计算。为避免流动相流速过大造成柱子压力过高，选定流速为1.0ml/min。2.4.1.2 流动相、漂移管温度及N2流速的选择根据ELSD软件，针对不同比例的流动相，系统提供相应的漂移管温度以及N2流速参考值，按照参考值设定ELSD检测器，得到相应得23-乙酰泽泻醇B峰的保留时间。表2.4-1 ELSD 2000 Control软件 乙腈-水：漂移管温度参考值N2流速参考值保留

40、时间（T） 2.1 2.0 2.0 1.9 1.8 综合考虑峰形和经济成本，决定选用流动相比例为乙腈-水（92：08），并对系统提供的漂移管温度以及N2流速参考值作相应调整，确定漂移管温度为82，N2流速为2.0L/min。2.4.2 线性范围考察分别精密取上述系列浓度对照品溶液各20ul进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为:Y=494467X-4426.9,r=0.9999。结果显示泽泻醇B23-乙酸酯在0.1384ug0.6920ug之间有良好的线性关系。见图2.4-1，表2.4-2。17华 中 科 技 大 学 硕 士 学

41、 位 论 文表2.4-2 HPLC法测定23-乙酰泽泻醇B含量的线性范围实验结果序号进样量(ug)峰面积-4426.90.99994944672.4.3 稳定性试验同一对照品溶液（浓度为0.6920mg/ml），隔2h测1次，每次进样20ul。结果表明，供试液中23-乙酰泽泻醇B在12h内稳定。其峰面积RSD为2.43%。见表2.4-3。表2.4-3 23-乙酰泽泻醇B的稳定性实验结果 时间(h)进样量(ul)峰面积峰面积平均值RSD(%)2.439981872 18华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文结果表明，对照品溶液在8小时内基本稳定。 2.4.4 精密度考察试验按照最佳工艺制

42、备供试品溶液，连续进样5次，测定峰面积，结果RSD为1.04%。见表2.4-4。表2.4-4 精密度考察试验结果序号进样量(ul)峰面积峰面积平均值RSD(%)1.04284820 试验结果表明，精密度良好。2.4.5 重现性试验分别取同一批样品的泽泻粗粉20g，按照供试品溶液的制备方法，平行操作5份，依法测定，结果23-乙酰泽泻醇B的平均含量为0.01840%，RSD为2.50%。见表2.4-5。表2.4-5 重现性试验结果 序号进样量(ul)峰面积峰面积平均乙酰泽泻醇B平均含量（%）0.01840RSD(%)2.50华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文2.4.6 回收率试验精密称取泽泻粗粉约20g，共7份，1份未加入