分析方法验证培训

1、 2.0验证前需要考虑的事情验证前需要考虑的事情概念 分析方法形成过程 验证需要考虑的因素 验证基本假设（前提） 现有验证指南缺陷 分析方法验证方案内容 仪器的确认 2 . 1概念 1 ：分析方法ICHQ2定义： 分析方法是指进行分析的方式，应详细描述每一个分析试验所必需的步骤 它包括，但不局限于：样品，参照对照品，试剂的配制，仪器的使用，标准曲线的绘制，计算公式的运用等2 . 1概念2 分析方法验证 化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则定义： 为使测试结果准确，可靠，必须对所采用的分析方法的科学性，准确性和可行性进行验证，以充分表明分析方法符合测试项目的目的和要求，这就是通常所说的对方法

2、进行验证2 . 2分析方法形成过程2 . 3什么情况分析方法需要验证？ 刚开发的分析方法 修正或建立分析方法用于新的问题 分析方法变更 分析方法在不同实验室，分析人员使用 不同仪器 证明两个分析方法的等效性2.4验证需要考虑的因素 确认并校验的仪器 文件化的方法 可靠地参数标准品 合格的分析人员 样品完整性2.5验证基本假设 前提） 专属性得到证明 方法己经是最佳条件 用统计学方法处理数据2.6 现有验证指南缺陷 仅仅提出了要求验证的项目 没有给出具体的验证方法 没有给出判断标准 一些验证中的实际问题没有指导原则2.7 分析方法验证方案内容 阐明目的和范围 责任 书面的分析方法 使用的物料与仪

3、器目录 每一参数的实验程序 统计方法 每一参数的验证标准2 . 8 仪器的确认 构造，型号和制造商手册 改造 安装确认和运行确认 校准程序 维护保养养计划3 . 0 不同验证具体要求 验证的范围 新方法验证步骤 方法转移验证 方法重新验证3 . 1 验证的范围 新方法要求进行完整的验证 药典的方法要求部分进行验证（确证） 重大要的变化需要进行部分再验证3 . 2 新方法验证步骤 开发新方法或从相关实验室获得新方法 制定验证方案，验证规程或验证主计划 确定方法（验证）适用的目标，范围 确定实验参数及可接受的标准 确定验证实验过程 确认验证使用的仪器相关性能3.2-新方法验证步骤（续1） 确认验证

4、所需的人员，试剂及标准 运行预验证试验 如果需要调整方法或接受标准 运行完整的验证试验 建立该方法的SOP用于日常分析工作 确定需要重新验证方法的标准3.2-新方法验证步骤（续2） 确定日常工作中系统适应性测试及/或分析质量控制检查的类型及频率 将验证过程，结果及结论总结形成完整的验证报告3.2.1概念3：替代分析方法FDA定义： 目的在于替代法规分析方法的分析方法3 . 2 . 2基本内容 专属性 检测限 定量限 精密度 线性与范围 准确度 耐用性3 . 2 . 3分析方法按特性分类 第一类主成分定量 第二类杂质或降解产物测定 第三类性能特点测定 第四类鉴别试验USPICHWHO选择性选择性

5、选择性线性度及范围 线性度线性度及范围范围准确度准确度准确度精密度精密度重复性精密度 中间精密度重现性检测限检测限检测限定量限定量限定量限耐用性耐用性耐受性3 . 2 . 4ICH,USP及WHO验证要求3.2.4.1FDA要求验证项目鉴别杂质限度杂志定量含量及溶出度 特性准确度-+ +重复性-+中间精密度-+专属性+检测限-+- - -定量限-+- -线性-+ -范围-+ -耐用性-+3.2.4.2ICH要求验证项目鉴别杂质限度杂志定量含量及溶出度准确度-+ +重复性-+中间精密度-+专属性+检测限-+- -定量限-+-线性-+范围-+耐用性3.2.4.3WHO要求验证项目鉴别杂质定量杂质限

6、度含量特性准确度-+ -+ + 精密度-+ -+ + 耐用性+ + + + + 线性和范围-+ -+ + 专属性+ + + + + 检测限-+ -定量限-+ -3 . 3方法转移验证 证明经过其它实验室的验证，并可以正式运行的分析测试过程，是否可以在本实验室运行，并适应实际的使用情况： 满足相应的测试要求 真实反映被测物相应的特性， 浓度，质量，纯度及效价情况3 . 3 . 1概念 4 ：法规分析方法FOA 定义： 是用于评佑原料药或制剂某一个规定特性的分析方法3.3.2概念5 :交叉验证FDA定义： 在同一个研究或不同交叉研究中，用两种或多种分析方法进行分析，对验证参数进行比较3 . 3 .

7、 3转移验证方法来源 官方认可的标准 USP/NF EP BP ChP JP AOAC 客户提供的，经过验证后的方法 相关实验室经验证后正在使用的方法3 . 3 . 4转移验证的要求 系统适应性及方法专属性必须验证 方法耐用性可以不验证 杂质测试方法检测限与定量限必须验证 其它验证项目根据实际情况决定，对于项目的选择与取舍应有详细的讨论3 . 3 . 5分析方法转移验证 分析方法转移方案及程序 精密度 准确度 耐用性 编写并批准的具体测试方法 熟练程度核实 新实验室正式验收3 . 4方法再验证 概念 需运行方法再验证的变更情况 方法再验证要求3 . 4 . 1概念 6 ：方法再验证 化学药物质

8、量控制分析方法验证技术指导原则定义： 在某些情况下，如原料药合成工艺改变，制剂处方改变，分析方法发生改变等，均有必要对分析方法再次进行全面或部分指标的验证，以保证分析方法可靠，这一过程称为方法再验证3 . 4 . 2需运行方法再验证的变更情况 改变药物合成工艺 改变制剂组成 改变分析过程 操作过程的更改 改变仪器，色谱柱等硬件 测试条件持续改变以适应系统适应性要求，且改变程度超出药典规定的方法耐用性验证范围3 . 4 . 3方法再验证要求 证实相应的变更发生后，原使用的分析测试过程： 能够继续保持其特有的性质（如专属性） 能够继续真正反映被测物的相应特性（检测限与定量限） 依靠变更情况确定重新

9、验证的内容与程度4 . 0其它 概念 参考文献4 . 1概念 7 ：系统适应性 在一个系统（主要是色谱分离系统）被使用前，检查其系统性能指标是否满足分析要求的过程 它是确保色谱系统质量性能的要素4 . 1概念8：接受标准FDA定义： 用于验收分析结果的数字限度，范围，或其他适当的计量4 . 2 一参考文献ICH 一 QZA Text on Validatlon of Analytical Procedure : ( 1994 ) ICH 一 QZB Validation on AnaIytical Procedures : Methodology： ( 1995 ) CDER Reviewer

10、 Guidance : Validation of ChromatographicMethod ( 1994 ) CDER Submitting Samples and Analytical Data for MethodValidations （1987 ) CDER Draft Analytical Procedures and Method Validation ( 2000 )CDER Bioanalytical Method Validation for Human Studles ( 1999 ) USP Vaildation of Compendial Methods ( cur

11、rent revlsion ) 中国药典：药品质量标准分析方法验证Validation of Analytical Procedure分析方法验证 第一部分：基本要求Validation of Analytical Procedure分析方法验证 第二部分：实验设计与操作1.0讲座目的 掌握验证试验设计 掌握验证试验操作 了解确定接受标准原则第一部分:基本要求Validation of Analytical Procedure 分析方法验证第二部分:实验设计与操作1.0讲座目的 掌握验证试验设计 掌握验证试验操作 了解确定接受标准原则2 . 0 一精密度概念容易混淆的精密度中术语重复性中间精密

12、度推荐重复性接受标准 AOAC 浓度与精密度关系重现性2 . 1 一概念 1 ：精密度lCH-Q2 定义：分析方法的精密度指在规定条件下，对均质样品，多次取样进行一系列检测结果的接近程度（离散程度）2 . 2 一容易混淆的精密度中术语仪器重复性 相同人员，仪器，日期，标准液方法重复性 相同人员，仪器，日期，重新配制标准液中间精密度 不同日期，不同分析人员，不同仪器2 . 3 一重复性概念推荐重复性测定方法2 . 3 . 1 一概念 2 ：重复性ICH -Q2 定义：重复性是指在同样的操作条件下，较短时间间隔的精密度2 . 3 . 2 一推荐重复性测定方法在方法规定的线性范围内重复测定 如 3

13、个浓度，每个浓度 3 次或 100 的测试浓度，测定六次 记录每次测定各组分响应计算各响应值与平均值之间相对标准偏差2.3.2.1-概念3：系统重复性相同条件下，同一分析人员对同一样品溶液多次测试结果的接近程度2 . 3 . 2 . 2 系统重复性实验 取同一均匀标准样品溶液连续重复测定六次记录每次测定各组分响应计算各响应值与平均值之间相对标准偏差2.3.2.3-概念4：方法重复性相同条件下，同一个分析人员对同一个均匀样品，多次取样测定所得结果的接近程度2 . 3 . 2 . 4 一方法重复性实验 取同一批号均匀样品 按照分析方法规定至少称量出六份 按含量测定方法测定每一份样品含量 计算每一次

14、测定的含量与平均含量之间的相对标准偏差2.4-中间精密度 概念 推荐中间精密度测定方法2 . 4 . 1 一概念 5 ：中间精密度ICH-Q2 定义 中间精密度指的是试验室内部条件改变，如：不同日，不同分析者，不同仪器等情况下的精密度2 . 4 . 2 推荐中间精密度测定方法 应确定随机事件对分析方法精密度的影响，如不同日期，不同分析人员，不同仪器等等 没有必要一一考察 用均匀设计，或正交设计方法2 . 5 一推荐重复性接受标准 系统重复性 S/N1000,RSD S/N100,RSD2% S/N10,RSD4% S/N10,RSD8% 方法重复性 测定结果的相对偏差 仪器分析小于2% 容量分

15、析小于0.3%2 . 6 AOAC 浓度与精密度关系浓度（%）比率单位RSD（%）1001100%1.31010-110%2.7110-21%2.80.110-30.1%3.70.0110-4100ppm5.30.00110-510ppm7.30.000110-61ppm110.0000110-7100ppb150.00000110-810ppb210.000000110-91ppb302.7-重现性 概念 什么时候需要作重现性2 . 7 . 1 一概念 6 ：重现性ICH Q2定义： 重现性指不同试验室之间的精密度2.7.2-什么时候需要作重现性？ 是比较实验室间的差异 当一个方法要升级到法

16、规方法时，需要做这个工作3 . 0 准确度 概念 原料药准确度测定 制剂产品准确度测定 杂质准确度测定 推荐准确度测定方法 推荐准确度测定接受标准 AOAC 浓度与回收率关系3 . 1 概念 7 ：准确度ICHQ2 定义 分析方法的准确性指的是真实值或认可的参考值与测量值之间相近程度3 . 2 原料药准确度测定 用该方法分析已知纯度的分析物 该方法的分析结果与成熟的分析方法相比较，该成熟方法准确度是已知的 在精密度，线性，专属性建立后，进行推论3 . 3 制剂准确度测定 用该方法去测按处方量制成的混合物（加入已知量被测物） 在制剂中加入已知量主药或与另一成熟方法比较 在精密度，线性和专属性建立

17、后得出3 . 4 杂质准确度测定 在样品（原料浩挤）中加入已知量的杂质 无法得到杂质降解物的，与采用其他方法测得的结果比较，可以使用原料的响应值3 . 5 推荐准确度测定方法 在六个空白样品中，分别加入已知浓度的样品（浓度范围为含量测定浓度的 80120 % ) 计算该方法的百分回收率3.6推荐准确度测定接受标准 测定得到的主品的百分回收率与理论回收率100%间的相对标准偏差不得大于方法重复性相对标准偏差的4倍3.7AOAC浓度与回收率关系浓度（%）比率单位平均回收率（%）1001100%98-1021010-110%98-102110-21%97-1030.110-30.1%95-1050.

18、0110-4100ppm90-1070.00110-510ppm80-1100.000110-61ppm80-1100.0000110-7100ppb80-1100.00000110-810ppb60-1150.000000110-91ppb40-1204 . 0 检测限 概念 直观法 信噪比法 标准偏差和斜率法 推荐检测限测定方法4 . 1概念 8 ：检测限ICH Q2 定义 检测限度指的是样品中的被分析物质能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量4 . 2 直观法 直观评价可以用于非仪器分析方法，也可用于仪器分析方法 检测限的测定是通过对一系列已知浓度被分析物的样品进行分析，并以能准确（或

19、被可靠）地检测被测物的最小量或最低浓度来建立4 . 3 信噪比法 用于能显示基线噪音的分析方法把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较算出能被可靠地测出的最低浓度或量 一般以信噪比为3：1或2：1时相应的浓度或注入仪器的量确定检测限4 . 4 标准偏差和斜率法 根据响应值的标准偏差和斜率 检测限度（DL）=3 . 3 / s ：响应值的标准偏差（通过空白样品测背景响应值或Y轴截距） s ：校正曲线的斜率（通过被测物的校正曲线求得）4 . 5 推荐检测限测定方法 在最灵敏的仪器状态下 测定至少四个空白样品 洗脱时间需要覆盖整个样品中所有组分的样品溶液 每个样品进样三次 计算该组分的

20、最小检测限5.0定量限 概念 推荐定量限测定方法5 . 1 概念 9 ：定量限ICH Q2 定义： 某种分析方法的定量限度是指具有合适准确性和精密度的条件下，能够定量测定分析组分的最低限量。它是样品中含量低的化合物定量分析的参数，特别适用于杂质和（或）降解产物的测定5 . 2 推荐定量限测定方法 按检测限方法测定仪器的平均噪声 然后按信噪比等于10.00.5配置样品溶液 连续进样三次 计算组分的最小定量限6 . 0 耐用性 概念 变动因素 色谱分析中耐用性项目6 . 1 概念概念10:耐用性耐用性ICHQ2 定义 分析方法的耐用性是指试验参数适当地发生细小改变时，测量能力保持不受影响，可用于说

21、明正常使用时的可靠性6 . 2 变动因素 流动相的组成 pH值 不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱 柱温 流速等6 . 2 变动因素 典型气相色谱法变动因素 载气 流速 不同厂牌或批号的色谱柱 固定相 担体 柱温 进样口 检测器温度6.3色谱分析中耐用性项目分析方法变量所有分析样品制备操作提取时间HPLC浓度项组成不同的柱温度浓度GC不同的柱温度流量7 . 0 线性度 概念 线性范围 推荐线性度测定方法 推荐线性度测定接受标准7 . 1 概念11 ：线性度ICHQ2 定义 分析方法的线性是指在给定的范围内检测结果与样品中被分析物的浓度（含量）成比例关系的能力7 . 3 推荐线性度测定方法 在含量

22、测定浓度的70%-130%或50%-150%均匀选择至少六个不同的浓度点 每一个尝试至少需要测定四次 记录各对应浓度下的响应值7 . 2 推荐线性度测定接受标准 相关系数应当在0 . 999与1 . 000 之间 经线性回归处理 其截距不应明显地偏离零点8 . 0 专属性 概念 推荐专属性测定方法 降解研究内容8.1概念13：专属性ICH-Q2定义 专属性是指在一些可能存在的组分，如杂质，降解物，基质等存在时，对被分析物准确可靠测定的能力8.1推荐专属性测定方法 按照规定的标准或参考文献的色谱分析方法 分别将原料药，中间体，可得到杂质，原料，中间体，前体及降解产物的样品分别进样 记录各物质的相

23、对保留时间 确保各样品之间的峰可以分开 至少确保其他物质的峰与主峰分开8 . 2 概念 14 ：稳定性指示性分析方法FDA定义 稳定性指示性分析方法是一种验证了的定量分析方法，其能够测定原料药或药品在有关性质的变化 一个稳定性指示性分析能在没有降解产物，工艺杂质，辅助材料或其他的杂质干扰下，准确地对活性成分进行测量8 . 3 降解研究目的 降解途径 影响因素 确定包装 分析方法专属性8 . 4 降解研究内容 光 酸 碱 氧化 还原 高热 高湿Validation of Analytical Procedure分析方法验证 第二部分：实验设计与操作Validation of Analytical

24、 Procedure分析方法验证 第三部分：盐酸氟西汀验证实例1 . 1 目的 掌握色谱方法验证所需要的项目 掌握色谱验证基本实验方法 了解稳定性指示性方法验证的要求 了解析因分析在验证中应用1 . 2 简介 美国某公司生产10mg和20mg盐酸氟西汀两种相胶囊 其重量与配方相同仅盐酸氟西汀与辅料比例不同 所验证方法时公司内部对美国和欧盟市场产品放行和稳定性研究中使用的含量和杂质分析的方法 该分析方法已经建立1 . 3 验证项目清单 1 精密度 2 线性 3 范围 4 准确性 5 低浓度盐酸氟西汀验证 6 m -盐酸氟西汀验证 7 选择性 8 耐用性2 . 0 精密度 项目： 系统重复性方法重

25、复性中间精密度2 . 1 系统重复性 方法 按照分析方法要求，配制盐酸氟西汀标准溶液 重复进样 5 次 计算 峰面积平均值与相对标准偏差2 . 2 方法重复性 方法 按照分析方法要求，分别配制 20mg 盐酸氟西汀样品溶液 6 个分别进样 计算 含量相对标准偏差2 . 3 中间精密度 方法 由另外一个分析员，在不同日期，另外的仪器上，按照分析方法 分别配制 20 mg 盐酸氟西汀样品溶液 6 个 计算 含量及相对标准偏差3 . 0 线性 方法 正常含量分析用标准溶液浓度的 50到 200% 范围内 均匀选择 5个点 并配制相应浓度的盐酸氟西汀含量标准溶液 分别进样 计算 线性回归分析 相关系数

26、，斜率，Y轴截距4 . 0 范围 方法 正常20mg样品含量分析浓度50到200范围内 均匀选5个点 配制盐酸氟西汀样品溶液 分别进样 计算 线性回归分析 相关系数，斜率，Y轴截距5 . 0 准确性 项目 标准品准确性 样品准确性5 . 1 标准品准确性 方法 按照分析方法要求，配制盐酸氟西汀标准溶液重复进样 5 次 计算 准确性 测定浓度值用峰面积按照回归方程进行计算5 . 2 样品准确性 方法 按照产品标准量，在70到180正常标示量选均匀选择 4 个点，混合辅料与及盐酸氟西汀 每点3个样品，分别进样 计算 回收率测定浓度值用峰面积按照回归方程进行计算6 . 0低浓度盐酸氟西汀验证 项目：

27、 线性 准确性 系统重复性 定量限度 检测限度6 . 1 线性 方法 按照分析方法要求，均匀选择 6个点配制标示量的 0 . 02到 1 . 0 含量标准溶液 分别进样 计算 线性回归分析 相关系数，斜率，Y袖截距6 . 2 准确性 方法 配制杂质浓度的标准溶液 进样6次 计算 按峰面积用回归线性方程来计算测量浓度 平均值，相对标准偏差6 . 3 系统重复性 方法 配制工作浓度的 0 . 02和 0 . 05标准溶液 分别进样6次 计算 峰面积的平均值与相对标准偏差6 . 4 定量限度 用系统重复性实验中的标准偏和线性回归 方程中的斜率差计算6 . 5 检测限度 用系统重复性实验中的标准偏和线

28、性回归 方程中的斜率差计算7 . 0 m -盐酸氟西汀验证 项目： 线性 检测限度 定量限度 准确性 精密度方法重复性中间精密度 7 . 1 m-盐酸氟西汀简介 M -盐酸氟西汀是产品中的一个杂质 m -盐酸氟西汀在0 . 05- 1 . 0区间呈线性 相对响应因子（对盐酸氟西汀） F = 132 . 73952/74859534 = 1 . 87 . 2定量限度 根据 盐酸氟西汀定量限相对响应值 计算盐酸 m -氟西汀定量限度7 . 3 检测限度 根据 盐酸氟西汀检测限度 相对响应值 计算盐酸 m -氟西汀检测限度7 . 4回收 方法 分别6个标空白中加0 . 05的 m -盐酸氟西汀 进样

29、 计算 回收率实际检测值用峰面积按照回归线性方程计算7 . 5准确性 方法 在已知 m -盐酸氟西汀含量的样品中分别在0 . 4 % , 0 . 5和 0 . 6 % 3 个水平加入 m -盐酸氟西汀标准品 每组3个样品中 计算 回收率 实际检测值用峰面积按照回归线性方程计算7 . 6 重复性 项目 方法重复性 中间精密度7. 61方法重复性 方法 按照要求配制溶液 反复进样6次 计算 平均值 标准偏差 相对标准偏差7 . 62 中间精密度 方法 另外一个分析员，在不同日期，另外的仪器上按照方法重复性方法 配制溶液6次 分别进样 计算 含量及相对标准偏差8 . 0 选择性1.降解 2.系统适用

30、性 1）原样 3.空白 2）酸降解 4）氧化降解 5）日光降解 6）溶液加热降解 7）粉末加热降解8 . 1 简介 降解产物的选择性试验是分析方法稳定性指示性验证的一个重要部分 主要目的是通过试验证明各种降解的产物与所要分析的物质库完全分开 本试验中的主要设备是二极管矩阵检测器并通过计算：纯度角，匹配角，纯度阈值匹配阈值，含量来证明峰的纯度8.2原样品 方法 20mg胶囊按照规定的方法进行分析 标准品按照规定的方法进样分析8 . 3 酸降解 方法： 样品：称量大约等量20mg的样品，转移到 50ml 容量瓶中，加入20ml 稀释剂，并超声处理10分钟。加 lml的浓盐酸。放置18小时。用 10

31、N 氢氧化钠中和到 pH 5 . 5。稀释到刻度。过滤。 标准品：称量大约22mg 的标准品，转移到 50ml 容量瓶中，加入 20ml稀释剂，加2ml 的盐酸。放置18小时。用10N氢氧化钠中和到 pH5 . 5。稀释到刻度。8 . 4碱降解 方法： 样品：称量大约等量20mg的样品，转移到50ml容量瓶中，加入20ml 稀释剂，并超声处理10分钟。加 lml 的5N氢氧化钠。放置18小时。用5N盐酸中和到 pH 5 . 5。稀释到刻度。过滤。 标准品：称量大约22mg的标准品，转移到50ml容量瓶中，加入20ml 稀释剂，加2 ml的5N氢氧化钠。放置18小时。用5N盐酸中和到 p H5 . 5。稀释到刻度。8 . 5氧化降解 样品：称量大