间质胶原酶表达质粒对实验性大鼠肝纤维化的影响

1、    间质胶原酶表达质粒对实验性大鼠肝纤维化的影响        【摘要】 目的 观察间质胶原酶(MMP-1)表达质粒对大鼠肝纤维化的影响。 方法 运用逆转录巢式PCR和重组DNA技术，构建大鼠MMP-1真核细胞表达质粒，经脂质体包埋后，利用腹腔注射将其导入免疫性大鼠肝纤维化模型体内；通过RT-PCR，、型胶原的免疫组化以及Masson胶原染色观察MMP-1表达质粒对大鼠肝纤维化的影响。 结果 MMP-1表达质粒可促进肝脏中、型胶原的降解(P0.01)，且作用较秋水仙碱为强

2、（P0.05）；在病理形态学的观察方面，MMP-1表达质粒对肝纤维化有一定的逆转作用(P0.05)，但与秋水仙碱相比差异无显著性(P0.05)。 结论 MMP-1表达质粒对肝纤维化有一定的逆转作用，但作用有限。【关键词】 肝纤维化 金属蛋白酶类 型胶原 型胶原Effects of MMP-1 expressing plasmid on rat liver fibrosisYANG Changqing, HU Guoling, TAN Deming, et al.Institute of Infectious Disease, Xiangya Hospital, Hunan Medical Un

3、iversity, Changsha 410008【Abstract】 Objective To observe the effects of MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1) expressing plasmid on rat liver fibrosis. Methods We constructed the rat's MMP-1 recombinant plasmid which can be expressed in eucaryotic cells. After encapsulating the MMP-1 recombinant pla

4、smid by lipofectin, we transferred it to the rat's fibrotic liver in vivo intraperitoneally, then observed the effects of the plasmid on the fibrotic liver by RT-PCR, immunohistochemistry and the observation of pathology. Results The recombinant plasmid of MMP-1 could increase the degradation of

5、 type and type collagen in the rat's fibrotic liver according to immunohistochemistry compared with fibrotic modal group(P0.01) or compared with colchicine group(P0.05). According to the observation of pathology, recombinant plasmid of MMP-1 has some reverse effects on the rat's fibrotic liv

6、er compared with fibrotic model group(P0.05),but no obvious difference was found between the plasmid and colchicine(P0.05). Conclusion The recombinant plasmid of MMP-1 has some reverse effects on liver fibrosis, but the effects is limited. 【Key Words】 Liver fibrosis Metalloproteinase Type collagen T

7、ype collagen 我们运用DNA重组技术构建可表达大鼠间质胶原酶（MMP-1）基因的真核细胞表达质粒，并利用脂染体包埋处理，将其导入免疫性大鼠肝纤维化模型体内，并观察其对大鼠肝纤维化的影响。材料与方法一、构建重组质粒1. 引物的设计与合成： 根据MMP-1的全基因cDNA序列1设计PCR扩增用引物，并在引物的5'端加入有关克隆用酶切位点。引物设计后，由中国科学院上海细胞生物所赛尔(Cell)公司合成。 2. 肝脏RNA的提取和RT-PCR扩增MMP-1 ：取正常Wistar大鼠新鲜肝组织约100mg，用TRIZOL RNA分离液(Gibco，USA)提取肝脏Total RNA。

8、以此RNA为模板，经逆转录药盒(Gibco，USA)合成MMP-1的cDNA第一链。再以此cDNA为模板，运用巢式PCR扩增MMP-1全cDNA长度1458bp。3. MMP-1表达质粒的构建：纯化、回收MMP-1的PCR产物(Promega，USA)，用此产物先构建T载体(Promega，USA)克隆，再从T载体中切下目的片段，按顺序插入真核细胞表达质粒pcDNA3中，即构建真核细胞表达质粒pcDNA3/MMP-1。4. 结果鉴定：克隆结果分别经酶切和DNA测序进行鉴定(全自动测序仪377型，PE公司产品，USA)，结果均证实克隆构建成功。二、动物实验1.模型制备: Wistar大鼠，雌性，

9、55只，体重120150g，除6只用作正常对照外，其余参照王宝恩等2用人血白蛋白免疫攻击的方法制备大鼠免疫性肝纤维化模型，抗大鼠IgG单抗为法国库尔特(Coulter)公司产品。2. 动物分组：实验动物经过2次静脉免疫攻击后，按随机分组法对存活动物进行分组。C(-)组(模型组)，按计划静脉注射白蛋白免疫攻击制作模型，不给予其他任何干预因素。 C(+)组(秋水仙碱治疗组)，自静脉攻击两周后给予秋水仙碱灌胃治疗，按0.28mg/kg给药，6次/周。M1 组（MMP-1预防组）：自静脉攻击周后给予MMP-1重组质粒50mg，每周次至第8周。M2组(MMP-1治疗组)：自静脉攻击周后给予MMP-1重组

10、质粒50mg，每周次至第8周。N组(正常对照组)：每次静脉攻击时只注射等量生理盐水。除正常对照组外，其余各组实验动物白蛋白静脉攻击按计划进行。3. 重组DNA导入活体动物体内：提取、纯化重组质粒pcDNA3/MMP-1。运用凝胶电泳法确定重组质粒与Lipofectin的最佳配比关系为1mg质粒DNA ：5ml Lipofectin。取50mg重组质粒DNA与相应的脂质体包裹后，腹腔注射。三、观察结果实验动物在静脉攻击第8周结束后，麻醉、取肝组织后处死。部分肝组织作抽提RNA用，部分肝组织置于Carnoy组织固定液中，待作病理学检测和免疫组织化学用。1. RT-PCR检测MMP-1的表达：每样本

11、取Total RNA 0.4mg作逆转录模板，设计套式引物，外引物：M1 5-ACGCTCCAAAGGCTACAAC-3，M2 5-TCTACACCTAAGAGTAACC-3；内引物：M3 5- GGAGCCCTGATGTTTCCC-3，M4 5-CGTA ACCCTAATACTCTTTG-3，预计扩增片段长度为753bp；引物设计后，由中国医学科学院上海细胞生物所赛尔(Cell)公司合成。内对照引物(扩增b-actin)：b1 5-AACCGCGAGAAGATGAACCAGATCATGTT T-3，b2 5-AGCAGCCGTGGCCATCTCTTGCTC GAAGTC-3，套式扩增时，内外

12、引物使用相同,预计扩增片段长度为335bp。运用重组质粒pcDNA3/MMP-1制备探针并采用地高辛标记，方法参照分子克隆3及分子生物学常用实验方法4，用Southern blot对RT-PCR产物进行鉴定。RT-PCR反应结束后，2%琼脂糖凝胶电泳, 再将凝胶置于像分析仪(Eagle Eye 型，USA)上，对反应产物进行定量处理。 2. 病理形态学观察：组织切片用Masson胶原染色法观察。肝纤维化病理学分级参照王宝恩等5的标准。3.、型胶原的免疫组化：、型胶原免疫组化试剂盒为武汉博士德生物制品公司产品，方法参照药盒说明。实验结果用象分析仪(Eagle Eye 型，USA)量化处理。4.

13、统计学处理：MMP-1的表达及、型胶原免疫组织化学的量化结果使用SPSS 7.0 软件作方差分析(多样本均数内的两两比较)，病理形态学的观察结果使用EPI 5.0 软件作趋势分析卡方检验。结果1. MMP-1的表达：(1)M1、M2 组，其MMP-1的表达均较其他组显著增高(P0.05P0.01)，但M1、M2组之间差异无显著性(P0.05)。(2)C(-)组与C(+)组中MMP-1的表达均较N组有所增高，但差异无显著性(P0.05)；C(-)组与C(+)组之间差异无显著性(P0.05)(表1)。表1 MMP-1表达质粒对实验动物肝组织中MMP-1和、型胶原的影响组别样本数MMP-1型胶原型胶

14、原N60.95±0.0562.35±17.6299.90± 19.38C(-)61.32±0.12402.85±77.93#699.20±102.07#C(+)71.29±0.20310.70±66.49#*516.25± 71.16#*M182.07±0.32#*228.23±45.31#*+384.10± 44.72#*+M281.85±0.40#*247.18±41.18#*+415.90± 59.69#*+C(-)：模型组；C(+)：秋水

15、仙碱治疗组；M1：MMP-1预防组；M2：MMP-1治疗组；各实验组与正常对照组(N)相比，#表示P0.01，#表示P0.05；各治疗组与模型组相比，*表示P0.01，*表示P0.05；基因治疗组与秋水仙碱组相比，+表示P0.05。 2. 病理形态学观察：(1)各实验组与N组之间的病理学分级差异均有显著性(P0.05P0.01)。(2)M1、M2组与C(-)组之间差异有显著性(P0.05)；C(+)组与C(-)组之间的差异不显著(P0.05)。(3)M1、M2组与C(+)组之间其病理学分级差异无显著性(P0.05)。(4)M1、M2组之间差异均无显著性(P0.05)（表2）。表2 实验动物肝纤

16、维化的级别分布组别肝纤维化分级合计0N60000006C(-)#00000336C(+)#00012227M1#*00232108M2#*00123208C(-)：模型组；C(+)：秋水仙碱治疗组；M1：MMP-1预防组；M2：MMP-1治疗组；各实验组动物与正常对照组(N)的差异性比较，#P0.05，#P 0.01；各治疗组动物与模型组的差异性比较，*P0.05，*P0.01。 3. 、型胶原的免疫组织化学：由表1可见：(1)所有实验组动物的肝组织切片的、型胶原含量均较N组显著增多(P0.05P0.01)。(2)C(-)组的、型胶原含量均较其他实验组显著增多(P0.05P0.01)。(3)M

17、1、M2组的I、III型胶原量较C(+)组明显减少(P0.05)。(4)M1组与M2组之间，、型胶原含量差异无显著性(P0.05)。讨论MMP-1主要作用于、型胶原，且对、型胶原的降解能力相近6，所以我们把、型胶原的含量变化作为观察的主要指标之一。研究发现， MMP-1基因治疗组和秋水仙碱治疗组的、型胶原含量均低于模型组，提示干预因素对肝纤维化的治疗有一定效果，所有实验组动物肝组织切片的、型胶原含量均显著高于正常对照组，提示干预因素在一定的时期内，均未能使纤维化肝脏恢复正常。 在肝纤维化的研究中，病理学观察的内容是各种因素干预后的最终结果，因而具有特殊的意义。我们发现，所有实验组与正常对照组的

18、肝组织病理学分级均有显著差异，说明使用MMP-1基因或秋水仙碱进行治疗，一定时间内还不能使病变肝脏恢复至正常。基因治疗组与秋水仙碱治疗组之间无显著差别，而秋水仙碱治疗组又与模型组之间无显著差别，所以尽管基因治疗组与模型组之间的差别显著，但我们也认为单纯使用MMP-1作基因治疗疗效有限。 在肝纤维化的形成过程中MMP-1的表达并未见减少，甚至还有所增加；而通过外源基因的导入增加了MMP-1的表达，虽然对胶原的降解有所促进，但并未使得肝纤维化显著逆转，提示胶原酶数量上的变化并不是影响胶原降解的主要因素；如果从提高胶原酶活性的角度去研究胶原等细胞外基质的降解可能会更有意义。志谢 湖南医科大学湘雅医院病理科程瑞雪教授、冯德云讲师的大力帮助。杨长青男,34岁,博士后,主要从事肝纤维化分子病理和基因治疗的研究.作者单位:410008长沙,湖南医科大学湘雅医