质粒DNA提取鉴定ppt课件

1、质粒DNA提取、鉴定暨大医学院生化教研室蒋建伟 质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子补充：部分质粒为RNA） 。在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector)。 有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。 质粒质粒plasmidplasmid）：存在）：存在于细菌染色体外的小于细菌染色体外的小型环状双链型环状双链DNADNA分子，分子，可在宿主细胞中自主可在宿主细胞中自主复制，并在

2、细胞分裂复制，并在细胞分裂时传给子代。时传给子代。 质粒感染细菌后，会质粒感染细菌后，会赋予宿主细胞一些遗赋予宿主细胞一些遗传性状如对青霉素传性状如对青霉素或重金属的抗性或重金属的抗性) )可作可作为筛选转化子细菌的为筛选转化子细菌的根据。根据。 质粒分类： 严紧型每个细胞15个质粒）， 当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次； 松弛型每个细胞10200个质粒）。如果用一定的药物处理还会使质粒拷贝数增至几千份。 一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。 质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。 pBR322质粒(4363

3、bp) : 主要包括：限制性内切酶位点插入外源基因）；含有terr、ampr抗药基因，可作为筛选标志。含有复制起始点ori赋予其复制特性）。四环素抗性基因（Tetr失活( (插入失活法插入失活法) )抗药性标记选择抗药性标记选择M13M13噬菌体：噬菌体： M13mpM13mp系列系列 pUCpUC系列系列 pUCpUC质粒质粒: :含含E.coliE.coli的的LacZLacZ的的N N端端146146个个AAAA残基残基的编码基因，编码产物为的编码基因，编码产物为半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的片段。片段。 LacLacE.coliE.coli突变型宿主细胞）：可表达该突变型宿主细胞）：可表达该

4、酶的酶的片段片段. .单独存在的单独存在的或或片段均无活性，只有宿主细片段均无活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段，宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段，宿主细胞才有胞才有半乳糖苷酶活性，使特异底物产半乳糖苷酶活性，使特异底物产生蓝色化合物生蓝色化合物-互补互补) )。 互互补补的的检检测测片段片段片段片段片段片段片段片段本实验： 大肠杆菌pEC-ct质粒， pEC-ct质粒：8.0kb (6.8kb) 有Hind , BamH 酶切点，可切出CD基因1.2kb） 本实验包括： 1. 细菌培养和质粒扩增 2. 菌体收集 3. 菌体裂解、质粒DNA提取、纯化 4. 鉴定2人一组操作操作细菌

5、的培养细菌的培养接种：从接种：从-20取出菌种，斜面划线接种，取出菌种，斜面划线接种，37培养培养24h单克隆培养：单克隆培养：挑单个菌落，接种于挑单个菌落，接种于LB培养液中培养液中含含Amp50g/ml)4-6h。菌液菌液0.2ml10mlLB培养基含培养基含Amp50g/ml)37培养过夜。培养过夜。周四A.M.10：00 每小组来一个代表，在林春兰老师指导下完成。4. 扩大培养：培养液3 ml,接种于60 mL 的LB培养液含Amp 50g/ml),振摇200 rpm， 37 (4-6 h), 使A5800.4-0.6。5. 加氯霉素：加氯霉素，终浓度40 g/ml，继续培养15-17

6、h.周五P.M.由林春兰老师完成。周五A.M. 10:00 每小组来一个代表，在林春兰老师指导下完成。周六周六8:00.去医学院去医学院7楼，楼，2人人/份份1.取取6个个1.5mlEppendorf管，分别加细菌培管，分别加细菌培养液养液1.4ml9000rpm2-3min 弃上清弃上清2.600lSTE液依次溶解各管沉淀，合并一管液依次溶解各管沉淀，合并一管再用再用200lSTE液清洗各管，清洗液合并上液清洗各管，清洗液合并上管收集菌体管收集菌体）9000rpm2-3min,弃上清弃上清（保留菌体）（保留菌体）收集菌体收集菌体3。沉淀悬于。沉淀悬于200ul溶液溶液I，混匀，混匀放置放置5

7、min4。加入。加入400ul溶液溶液II，颠倒混匀数十次，颠倒混匀数十次2030次）次）0.2NNaOH-1%SDS放置放置5min5。加入。加入300ul溶液溶液III，充分混匀温和操作），充分混匀温和操作）10min沉淀DNAKAc-HAc裂解碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNARNase12000rpm3min 弃沉淀弃沉淀6。将上清转移至另一。将上清转移至另一Eppendorf管中，加管中，加0.6倍体积异丙醇倍体积异丙醇(540ul)，倒转混匀，倒转混匀室温室温5min离心离心12000rpm10min 弃上清弃上清沉淀干燥，室温沉淀干燥，室温5min7。加。加TE500ul溶解

8、沉淀溶解沉淀同时倒胶1%,330ml/小班沉淀质粒去除基因组DNA和蛋白8。加入等体积饱和酚，振摇。加入等体积饱和酚，振摇1min，充分混匀，充分混匀12000rpm5min9。将上层水相转移至另一。将上层水相转移至另一Eppendorf管中，管中，用等体积氯仿用等体积氯仿-异戊醇抽提，振摇异戊醇抽提，振摇1min，充，充分混匀分混匀12000rpm5min10。将上层水相转移至另一。将上层水相转移至另一Eppendorf管中，管中，加入预冷的加入预冷的2.5倍体积无水乙醇倍体积无水乙醇-2030minLunch time纯化质粒纯化质粒易错离心离心12000rpm10min 弃上清弃上清沉淀

9、干燥沉淀干燥11。加入。加入TE30-50-100ul,溶解沉淀溶解沉淀（反复吹打至（反复吹打至完全溶解）完全溶解）EP管上做记号质粒的分离、纯化半定量检测浓度酶切电泳鉴定 鉴定质粒 线性化质粒，电泳后与marker比较，估计质粒大小。 线性化： 用Hind将质粒酶切、电泳，估计其分子大小。 双酶切：用Hind和BamH 将质粒pEC- CT所含的CD基因1.2kb片段切出。鉴定鉴定(质粒分子量、纯度及是否含有所需要质粒分子量、纯度及是否含有所需要DNA段段)(一一)酶解酶解双酶切体系：双酶切体系：单酶切体系：单酶切体系：sample5ulsample5ulBamH1ulHind1ulHind

10、1ul10buffer2.5ul10buffer2.5ulddH2O15.5ulddH2O16.5ul混匀，离心混匀，离心(瞬时瞬时)，37113。DNA浓度测定浓度测定溴乙锭荧光法溴乙锭荧光法(半定量法，一大组半定量法，一大组/板板)（1制备1 %琼脂糖凝胶板塑料平皿中凝固后待用。（2点样： 标准溶液 （Marker：老师加） 1.0 0.5 0.25 0.1 0.05 0.025 0.01 ug/ul 分别吸取1ul点于制好的琼脂糖平板上 样品 吸取1ul，滴加于琼脂板上。 (3) 浓度测定： 避光，小时后，在紫外灯下观察各点荧光强弱，从而 估计样品DNA浓度。14。电泳。电泳1.制胶制胶2.点样点样（1质粒提取液质粒提取液5ul+TE15ul（2单酶切液单酶切液25ul（3双酶切液双酶切液25ul各加上样液溴酚兰各加上样液溴酚兰5ul（4Marker老师加老师加4小组小组3道道12道道Marker1道道画示意图 3.电泳电泳 电压：电压：120V2min100V0.5-1.0h 待溴酚蓝走至待溴酚蓝走至6-7cm左右，终止电泳。左右，终止电泳。 观察结果：紫外灯下，照相。观察结果：紫外灯下，照相。markerDL15000:15000,10000,7500,5000,2500,1000,250bp上样液：上样液：50甘油、甘