大实验—土壤酶活性的测定

1、脲酶活性的测定采用奈氏比色法以1 g干土24 h生成的NH3- N量为脲酶的1个活性单位41过氧化氢酶活性的测定采用高锰酸钾滴定法酶活性以1 g干土1 h内消耗的01 mol·L-1KMn04体积数(以ml计)表示42多酚氧化酶活性的测定采用邻苯三酚比色法，以1 g干土3 h内生成的没食子素的量为多酚氧化酶的1个活性单位43，脱氢酶活性的测定采用三苯基四氮唑氯化物作为氢受体。被还原后生成红色的甲臜，用比色法测定，以1 g干土6h生成的甲臜质量为脱氢酶的1个活性单位44。1. 脲酶活性的测定苯酚钠比色法（1） 标准曲线的绘制吸取稀释的氮的标准溶液1，4，7，10，13，16，19mL，

2、移入50mL容量瓶中，然后加蒸馏水至20mL。再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。绘制的标准曲线如图4-1所示：图4-1脲酶标准曲线（2） 操作步骤取5g风干土，置于50mL三角瓶中，加1mL甲苯。15min后加10mL10%尿素液和20mL PH6.7柠檬酸盐缓冲液。摇匀后在37恒温箱中培养24h。过滤后取3mL滤液注入50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的毫克数表示。2. 过氧化氢酶活性的测定高锰酸钾滴定法（1

3、） 操作步骤取5g土壤样品于100mL三角瓶中（用不加入土样的作空白对照），加0.5mL甲苯，摇匀，于4冰箱中放置30min。取出，立刻加入25mL冰箱储存的3%H2O2水溶液，充分混匀后，再置于4冰箱中放置1h。取出，迅速加入冰箱储存的2mol/L H2SO425mL，摇匀，过滤。取1mL滤液，用0.05mol/L的KMnO4滴定。（2） 计算根据对照和样品的滴定差，求出相当于分解的H2O2的量所消耗的KMnO4。酶活性以每g干土1h内消耗的0.1mol/L KMnO4体积数（以mL计）表示。3. 脱氢酶活性的测定三苯基四氮唑氯化物（TTC）还原法（1）方法原理脱氢酶能酶促脱氢反应，它起着氢

4、的中间传递体的作用。在土壤中，碳水化合物和有机酸的脱氢酶作用比较活跃，它们可以作为氢的供体。脱氢酶能自基质中析出氢而进行氧化作用。用三苯基四氮唑氯化物作为氢的受体，进行比色测定，以溶液的光密度值表示酶活性。（2）TPF标准曲线的绘制于干净20mL具塞试管中，依次加入2mL0.5mol/LTris-HCL缓冲液（pH=7.6）、2mL蒸馏水和2mL不同浓度的TTC标准溶液，然后加入0.1g低亚硫酸钠（保险粉），振荡摇匀。待充分显色后，加入5mL甲苯，振荡萃取TPF，上清液于485nm处测定吸光度值。以TPF的浓度为横坐标，以OD485值为纵坐标绘制标准曲线。绘制的标准曲线如图4-2所示：图4-2

5、TPF标准曲线（3）操作步骤称取5g土壤样品，置于干净具塞试管中，每支试管加入2mL1%的TTC溶液，2mL蒸馏水，充分混匀。置于37条件下避光培养6h。培养结束后，加入5mL甲醇，剧烈振荡1min，然后静置5min，再振荡20s，然后静置5min。将具塞试管中的物质全部过滤到比色管中，并用少量甲醇洗涤具塞试管23次，洗涤液也全部过滤到比色管中，定容到25mL，于485nm下测定吸光度值OD485，以每g干土6h生成的TPF为脱氢酶的一个活性单位。4. 多酚氧化酶活性的测定邻苯三酚比色法（1）标准曲线的绘制取重铬酸钾标准溶液，用0.5mol/LHCl稀释成各种不同浓度。定容后，在分光光度计上于

6、430nm处比色测定。以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。绘制的标准曲线如图4-3所示：图4-3 重铬酸钾标准曲线（2）操作步骤称取1g风干土壤样品（过0.25mm筛），置于50mL三角瓶中，然后注入10mL1%邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30恒温箱培养2h。取出后加4mLPH4.5柠檬酸磷酸缓冲液，再加35mL乙醚，用力摇荡数次，萃取30min。最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。比色时用波长为430nm的滤光片，为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用无水乙醇洗涤比色液槽一次。为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正没食子素的纯度，需设无基质的土壤和无土壤的