铬对糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4 基因表达的影响_图文

1、196铬对糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4基因表达的影响孙 忠，吴蕴棠，车素萍，王 夏1，郭 刚（天津医科大学公共卫生学院，天津300070；1中国科学院微生物研究所，北京 100080）【摘 要】目的：探讨补铬对糖尿病大鼠糖代谢相关基因表达的影响。方法：对前期研究分离到的与补铬200 µg /（kg bw d）有关的糖尿病大鼠差异显示的基因片段进行克隆、测序及同源性分析，根据待检测的基因序列进行引物设计，进行RT-PCR 检测。以激光密度扫描仪进行光密度扫描分析，以目的基因与参考基因的灰度比值反映其表达水平。结果：差显片段Cr-3的碱基序列与GLUT4同源性为98%。各组大鼠骨骼肌组织中

2、GLUT4 mRNA 的表达：糖尿病补铬组GLUT4表达量低于正常对照组(P <0.05，高于糖尿病对照组(P <0.05。结论： 给糖尿病大鼠补充微量元素铬可以上调骨骼肌组织中GLUT4 mRNA 的表达，进而使骨骼肌组织中GLUT4含量增加，这可能是铬改善糖尿病大鼠糖、脂代谢紊乱的分子机制之一。关键词： 葡萄糖转运因子4(GLUT4；糖尿病大鼠；RT-PCR；基因克隆；铬 中图分类号：R151.3 文献标识码：A 文章编号：0512-7955(200503-0196-04STUDY ON REGULATION OF CHROMIUM ON GLUT4 EXPRESSION OF

3、 SKELETALMUSCLE IN DIABETIC RATSSUNZhong ，WU Yun-tang，CHE Su-ping，WANG Xia，GUO Gang ( School of Public Health, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China【Abstract 】Objective: To study the regulation of chromium on the related gene expression of glucose metabolism in skeletal muscle in diabeti

4、c rats. Methods : cDNA fragments were cloned, sequenced from our former research and its homology analysis has been done. RT-PCR was performed using the primers designd according to the sequence of cDNA. Results : The sequence identities between Cr-3 and GLUT4 were 98%. The GLUT4 mRNA expression lev

5、el of DM+Cr group was obviously lower than that of normal group (P <0.05, and higher than that of DM group (P <0.05. Conclusion: Chromium supplementation can increase the expression level of GLUT4 mRNA and the content of GLUT4 in skeletal muscle in diabetic rats. It may be one of the mechanism

6、s that chromium can partially improve the disorders of glucose and lipid metabolism in diabetic rats.Key words： GLUT4；diabetic rat；RT-PCR ； gene clone ；chromium微量元素铬作为葡萄糖耐量因子的重要组成部分，对于改善受试者的胰岛功能及糖耐量具有一定的作用1，但对糖尿病相关基因的表达影响，国内报道较少。我们在前期研究中对糖尿病大鼠收稿日期：2004-08-20基金项目：天津市高等学校科技发展基金(No.01-20804；天津市自然科学基金(N

7、o.9903606611 作者简介：孙忠(1964-，男，硕士，副教授营养学报2005年第27卷第3期 197每日以200 µg/kg bw的剂量灌胃补铬60 d后，提取大鼠骨骼肌组织总RNA，以mRNA 差异显示技术分离到400 bp 以上的cDNA 片段11条。本研究拟对这些cDNA 片段进行克隆、测序、同源性分析等，以期发现铬调控糖尿病代谢紊乱的相关基因及其功能，为阐明作用的分子机制提供理论依据。1 材 料 与 方 法1.1 差异显示cDNA 片段与菌株cDNA片段来自前期研究的糖尿病补铬组与糖尿病对照组差异显示的cDNA 片段11条 2； E.coli DH5为中国科学院微生

8、物研究所新技术室保存；pGEM-T easy vector（Promega）。 1.2 主要化学试剂及仪器设备T 4DNA 连接酶（TaKaRa）、限制性内切酶Eco R 及Sac （Promega ）、质粒提取试剂盒（Promega）、Taq DNA 聚合酶（Gibco）、dNTP（Beckman）、X-gal （Promega）、IPTG （Promega）、Superscript逆转录酶（Gibco）、DNA热循环仪 (Perkin Elmer Cetus 公司 、紫外透射仪 (Cole-Parmer公司、UV-2510PC 型紫外分光光度计(日本岛津公司。1.3 方法 1.3.1 差异

9、显示基因片段的再扩增：扩增引物为：M13 reverse 24-mer primer：5,AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3,； T7 Promoter 22-mer primer：5,GTAATACGA- CTCACTATAGGGC 3, 。PCR反应条件：952min9215s，5030s，72 2 min，4个循环9215s，6030s，722min，25个循环727min4贮存。选择400bp 以上的片段进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收目的条带。 1.3.2 PCR 产物的克隆、测序及同源性分析：PCR产物的克隆按照说明书进行，酶切产物用1.0% 琼脂糖凝胶电泳鉴定大

10、小。鉴定酶切片段与插入片段等大小后进行测序，用美国国家生物技术信息中心(NCBI的Blastn 作为主要的检索工具，进行序列的同源性分析。 1.3.3 RT-PCR 鉴定：正常对照组(NC、糖尿病对照组(DM和糖尿病补铬组(DM+Cr大鼠，每组大鼠只，共24个骨骼肌标本，采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取总RNA，并经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检查其完整性。根据测序及同源性分析结果，对已知基因设计特异性引物（表），用于从各组RNA扩增已知差异基因，以验证该差异片段是否为假阳性。包括用于差异显示的3个RNA样品在内共27个RNA样品参加逆转录反应。PCR反应条件：95 5 min94 30s，60

11、 30s，72 45s，25个循环 72 7min4 贮存。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用激光密度扫描仪进行光密度扫描分析。Table 1 Base sequences of -actin and GLUT4GeneProduct length Primers-actinForward 611 GTCGTACCACTGGCATTGTGReverseCAGTGAGGCCAGGATAGAGC GLUT4Forward Reverse482ACATCAGGTGGTGGGAAGAG CACAGATGGAGCCATAGCA1.4 统计分析各组间表达水平用SPSS 11.5 for Windows

12、进行单因素方差分析。2 结 果2.1 差异显示基因片段的再扩增经mRNA 差异显示技术分离到DM+Cr组与DM 组之间出现明显差异的400 bp以上的cDNA 片段11条，分别以Cr-1Cr-11表示。其中Cr-3在NC 组、DM+Cr组中高表达，DM 组中低表达。用T7引物和Reverse M13引物对回收的片段进行再扩增反应。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后显示，扩增产物为单一片断，无杂片段污染。 2.2 差异显示基因片段Cr-3的克隆及酶切鉴定 上述Cr-3目的基因经连接、转化、质粒提取后，用Sac和EcoR进行两次酶切后，结果与预期相同，在预计位置上出现了特异条带（图1）。Marker:

13、 Lambda DNA/Eco130I DNA Marker; 1,3,5: products of Sac; 2,4,6: products of EcoRFig. 1 Enzyme restriction electrophoresis of thecloned Cr-3 plasmid198 2.3 差异显示基因片段的测序及分析结果将Cr-3基因的序列经BLAST n软件进行检索，结果显示Cr-3与GLUT4(葡萄糖转运因子4 的同源性为98%；测序全长为662；BLAST ID：1070559361-18835-4011920018 BLASTQ3；高同源性基因编号：gi|53686|

14、gb|36125.1|RATMEFGLUT；glucose transporter (GLUT4 Rattus norvegi- cus 全长：4542 bp。2.4 各组大鼠骨骼肌组织GLUT4基因的表达 以-actin做为内参照物，扩增GLUT4基因，其扩增产物为482 bp，-actin的扩增产物为611bp，见图26，表2。Table 2 mRNA expression of the validated differential genes in various groupsa:compare to NC group, P <0.05; b: compare to DM grou

15、p, P <0.05Fig. 2 GLUT4 mRNA expression in skeletalmuscle tissuesMarker: DL2000 marker; 1:NC；2:DM；3:DM+CrFig. 3 Validation of GLUT4 mRNA expression ofDD-PCR图2,3显示了3个骨骼肌组织中GLUT4 mRNA 的表达：GLUT4与-actin辉度比值，DM组较正常对照组明显降低，DM+Cr组较DM 组有一定提高。Marker: DL2000 marker; 18:NC groupFig. 4 GLUT4 mRNA expression i

16、n NC groupMarker: DL2000 marker; 18: DM groupFig. 5 GLUT4 mRNA expression in DM groupMarker: DL2000 marker; 18:DM+Cr groupFig. 6 GLUT4 mRNA expression in DM+Cr group表2,图46显示了各组大鼠骨骼肌组织中GLUT4 mRNA 的表达水平：DM组、DM+ Cr 组GLUT4表达量均低于正常对照组(P 0.05，DM+Cr组则高于DM 组(P 0.05，但尚未恢复到正常水平。3 讨 论葡萄糖分子进入细胞需要细胞膜上葡萄糖转运体（gluc

17、ose transporter,GLUT）的直接参与，这是组织利用葡萄糖的主要限速步骤。胰岛素刺激外周组织摄取葡萄糖主要是通过葡萄糖转运体异构体之一GLUT 4的作用实现3。胰岛素可使型DM 大鼠GLUT4 mRNA及GLUT4水平增加4。与GLUT4/-actin 0.975±0.076 DM 0.776±0.067a DM+Cr0.894±0.064ab营养学报2005年第27卷第3期 199非DM 大鼠相比，自发的型DM 肥胖大鼠骨骼肌细胞膜和细胞内膜上GLUT4含量分别减少50%和40%5；型DM 患者脂肪组织中GLUT4减少85%，GLUT4 mRNA

18、分别少于NC 和相同体重的非DM 患者86%和78%6，提示型DM 时外周组织所表现的胰岛素抵抗与G L U T 4的变化有一定关系。 本研究结果提示，DM组大鼠骨骼肌中GLUT4表达水平较正常对照组明显降低，可能是DM 动物模型外周组织产生胰岛素抵抗的原因之一。RT-PCR 验证结果还显示，DM+Cr组大鼠骨骼肌中GLUT4 mRNA 的表达水平虽然未达到正常水平，但较DM 组有所提高(P 0.05，提示给四氧嘧啶DM 大鼠补充铬可上调骨骼肌组织中GLUT4 mRNA 的表达，而使骨骼肌组织中GLUT4含量增加，这可能是铬改善DM 大鼠糖、脂代谢紊乱的分子机制之一。但补铬对骨骼肌组织中GLU

19、T4从胞内到脂膜的易位是否有促进作用，有待进一步研究。参 考 文 献1 Mertz W. Chromium in human nutrition:a reviewJ. J Nutr, 1993,123: 626633.2 吴蕴棠，孙忠，车素萍，等. 铬对DM 大鼠糖、脂代谢及骨骼肌组织基因表达的影响J. 营养学报， 2003,25: 256259.3 Tremblay F , Dubois MJ , Marette A. Regulationof GLUT4 traffic and function by insulin and contraction in skeletal muscleJ.

20、 FrontBiosci ,2003,8：10721084.4 Hoenack C, Roesen P. Inhibition of angiotensintype 1 receptor prevents decline of glucose transporter (GLUT4 in diabetic rat heart. J.Diabetes , 1996，45(suppl 1: S82S87.5 Marette A, AtGie C, Liu Z, et al. Differentialregulation of GLUT1 and GLUT4 glucose transpor- ter

21、s in skeletal muscle of a new model of type II diabetesJ. Diabetes , 1993,42: 11951201. 6 Garvey WT, Maianu L, Huecksteadt TP，et al.Pretranslational suppression of a glucosetransporter protein causes insulin resistance in adipocytes from patients with non-insulin- dependent diabetes mellitus and obe

22、sityJ. JClin Invest, 1991,87:10721081.* * * * *（上接195页）7 杜卫，张秀珍，梁惠. 尿中O 6-甲基鸟嘌呤与恶性肿 瘤关系的研究J. 肿瘤防治杂志，2003, 10：127 128.8 于守洋，刘志诚. 营养与食品卫生监督检验方法指 南M.北京：人民卫生出版社，1988. 129175. 9 石雁川，杨富清，陈炳卿，等. 抗坏血酸硬脂酸酯的维生素C 生物效应研究J. 营养学报，1996，18： 364366.10 Kovacikova Z，Ginter E，Madaric A. The effect of graded ascorbic acid intake on the activit