DDRT-PCR与反向Northern杂交技术结合分离马铃薯mRNA差异表达片段

1、农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2003,11( 5: 545546·研究简报·DDRT-PCR 与反向Northern 杂交技术结合分离马铃薯mRNA 差异表达片段*田振东1柳俊2谢从华1*宋波涛1（1. 华中农业大学园艺林学学院，武汉430070；2. 华中农业大学生命科学技术学院，武汉430070）关键词：DDRT-PCR ；反向Northern 杂交技术；银染显示；马铃薯Isolation and Identification of Differentially Expressed mRNA Species

2、 by DDRT-PCRCombined with Reverse Northern Hybridization in PotatoTian Zhendong 1Liu Jun 2Xie Conghua 1*Song Botao 1(1.Collegeof Horticulture and Forestry, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China ；2.College of Life Science and Technology ，Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070,

3、 ChinaDDRT-PCR ；reverse Northern hybridization ；silver staining display ；potato1聚丙烯酰胺胶电泳和银染显示差异片段取6 L在6%非变性聚丙PCR 产物加入4 L 2× DNA 上样缓冲液，烯酰胺胶垂直板（20cm × 30cm ）上用1× TBE 电泳缓冲液电泳，先于250V/10W 预电泳30min ，然后上样电泳45h, 直至溴酚蓝离胶底1.5cm 。电泳完毕，取下胶板银染。去离子水和灵敏度高的特点，已在动植物分子生物学研究领域得到广泛应用。该技术发展至今各技术环节已有不少改进2,

4、3，但还是存在假阳性频率高，筛选工作繁重的缺点。本实验将差异片段银染显示与反向Northern 杂交筛选技术4结合，探索适合马铃薯mRNA 差异表达分析的方法。1材料和方法1.1实验材料晚疫病病原菌（游动孢子诱导DNA差异条带再扩增与克隆将仅在处理对比染色结果，差异条带的反向Northern 杂交筛选每个差异片段48h 的温室生长的马铃薯叶片作为处理材料，未诱导叶片作为对照。实验所用锚定引物及随机引物polymerase 、dNTPs 和pUCm-T 载体均购自上海生工。1.25实验方法3g 处理与对照叶片用异硫氰酸胍法纯抽提总RNA 。取约10 g RNA 先用DNaseI 除去DNA ，化

5、后溶于10 L DEPC 处理的无菌水中。取4 g 除去DNA 的总RNA 加入2 L 10 mol/L的锚定引物（AAGCT 10C 或AAGCT 10G ），用1 L Superscript ( 逆转录酶（Life Technique ），以20L 体系按说明进行逆转录。PCR 反应体系为：逆转录产物1 L ，2.5 L 10× PCR Buffer ，2 L MgCl 2(25mmol/L，1 L dNTPs (2mmol/L，0.3 L*基金项目：国家"863" 项目（批准号：2002AA241181）。男，田振东：1971年生，华中农业大学作物遗传育种专

6、业2000级在读博士。*通讯作者。Author for correspondence. E-mail 收稿日期:2002-11-22接受日期:2003-01-03546农业生物技术学报2003年1滋L 的点样量对应点2张重复拷贝膜（Boehringer Mannheim ），点膜完毕将尼龙膜在0.5mol/LTris-HCl(pH恒温箱中120 烘膜307.5 中和5min ，用双蒸水漂洗后，min 。两张重复拷贝膜分别与DIG 标记的处理和对照cDNA 探针杂交，杂交和显色依据Roche 公司DIG High Primer 显色结果DNA Labeling and Detection Sta

7、rter Kit I 说明进行，用凝胶成像系统在可见光下扫描。对比2张重复拷贝膜杂交信号，选取仅与处理材料探针有杂交信号的克隆。送专业公司测序，测序结果用BLAST 软件进行序列分析比较。DDRT-PCR 操作中有两个关键问题需要解决：一是如何得到稳定、丰富和清晰的差异条带。二是如何有效地从差异片段中筛选出真正差异表达的片段。用本实验的DDRT-PCR 实验室常体系，采用垂直电泳槽非变性聚丙烯酰胺胶电泳、规试剂配制的银染溶液，在马铃薯上能够取得良好差异显示具体操作效果。由于所用试剂及配制银染溶液的水质差别，中应根据PCR 产物的效率，对分离上样量及银染时间做适当调整，才能得到清晰带型。序列胶上

8、显示的差异条带，往往混杂大小相同的非差异以此标记探针进行Northern 杂交，往往表达的共迁移片段，不能有效鉴定出阳性片段，而且1次Northern 杂交只能对1个片段筛选。本实验采用反向Northern 杂交筛选方法4，将差异片段插入载体，挑取一定数量单克隆，用载体通用引物扩有效筛增出插入片段，然后与两个探针分别进行斑点杂交，选出阳性片段。该方法可以同时对数十个差异片段平行点膜降低工作强度，具有简杂交，能够提高阳性片段选择效率，便、快捷和易于操作的特点。图3. 与对照材料制备探针杂交结果Fig.3. Reverse Northern blot results hybridized with

9、 control probeA16,six fragments came from A band; B16,six fragments came from B band.2结果和分析PCR 产物在非变性聚丙烯酰胺胶上垂直电泳分离后银染，能够分辨的带型大约在600bp 以下。图1显示用AAGCT 10C 与OPRH-12和AAGCT 10G 与OPRC-40分别对处理和对照材料RT-PCR 产物银染结果。切下图1箭头所示进行二次PCR 扩增，的两个条带，将产物克隆入pUCm-T 载体。PCR 扩增插入片段后点膜，与处理材料标记探针反向（图2）Northern 杂交结果显示，A 差异带所得克隆有2

10、个显示出较强杂交信号，而B 差异带所得克隆仅有1个显示出较强杂交信号。对照材料标记探针与A 、B 差异带所得克隆杂交信号均很弱（图3），可以视为背景干扰。图2A 1与B 4克隆测序与BLAST 检索结果表明，A 1为多酚氧化酶基因片段，B 4为晚疫病病原菌菌丝体cDNA 片段。3讨论图1. 处理(T与对照(CmRNA 差异显示Fig.1. mRNA differential display of tester （T ）andcontrol （C ）1. PCR amplification with AAGCT 10C and OPRH-12; 2. PCR amplification with

11、 AAGCT 10G and OPRC-40. Arrowheads show two differential bands (Aand B.参考文献1Liang P, Pardee A B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of polymerase chain reaction. Science, 1992, 257:9679712Liang P, Pardee A B. Recent advances in differential display. Curr Opin Immunol, 1995, 7:

12、2742803Tugores L B, Ledesma J. Differential display of eukaryotic mRNA. Methods Mol Biol, 1999，97:5755904von Stein O D, Thies W G, Hofmann M A. A high through put screening for rarely transcribed differtially expressed genes. Acids Res, 1997, 25:259826025Chomczynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation byNucl图2. 与处理材料制备探针杂交结果Fig.2. Reverse Northern bolt r