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1、南京农业大学学报2009,32(1:36-40Journal of N anjing A gricultural U niversity htt p:/nauxb 1njau 1edu 1cn 欧阳翔,吴婧,丁一新,等.灵芝漆酶基因转录Cu 2+诱导特性及其启动子的克隆与序列分析J .南京农业大学学报,2009,32(1:36-40灵芝漆酶基因转录Cu 2+诱导特性及其启动子的克隆与序列分析欧阳翔,吴婧,丁一新,李玉祥,赵明文3(南京农业大学生命科学学院/农业部农业环境微生物工程重点开放实验室,江苏南京210095摘要:以Cu 2+为诱导物检测了灵芝漆酶同工酶基因的转录特性,并对其启动子进行了
2、克隆及序列分析。研究发现:灵芝漆酶基因在Cu 2+的作用下表达量出现明显差异,其中以在发酵液中添加310mmol L -1Cu 2+、诱导时间为6d 时,漆酶基因的mRNA 表达量最高。根据Gen Bank 中已报道的灵芝漆酶基因的序列信息,经PCR 扩增获得了灵芝漆酶5端长879bp 的基因特异序列,进而通过self 2f or med adap t or PCR (SEF A 2PCR 方法,扩增得到灵芝漆酶基因起始密码子上游长832bp 的启动子序列。分析表明,该启动子区域除分布有T AT A 2box 、C AAT 2box 及GC 2box 等基本的转录起始元件外,还存在多个潜在的顺
3、式作用元件序列位点,包括4个MRE 元件、4个STRE 元件、11个HSE 元件和5个氮因子结合位点等。关键词:灵芝;漆酶;半定量RT 2PCR;self 2for med adap t or PCR;转录调控中图分类号:Q93915文献标志码:A 文章编号:1000-2030(200901-0036-05Cu 2+inducing characteristics of the transcri pti on of laccase genefr o m Ganoder m a lucidu m ,and cl oning,and analysisof the pr o moter of the
4、 geneOUY ANG Xiang ,WU J ing ,D ING Yi 2xin ,L I Yu 2xiang ,ZHAO M ing 2wen3(College of L ife Sciences/Key Laborat ory ofM icr obi ol ogical Engineering of Agricultural Envir on ment,M inistry of Agriculture,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China Ab s tra c t:Copper was taken as an ind
5、ucer t o investigate the transcri p ti on characteristics of the laccase is ozy me gene fr om Ganoder 2m a lucidum ,and the p r omoter sequence of the laccase gene was a mp lified fr om G 1lucidum genom ic DNA and analyzed .The ex 2p ressi on of the laccase gene in the G 1lucidum was significantly d
6、ifferent under the effects of copper in this study .The exp ressi on of mRNA of the laccase gene was the highest after treated by adding 310mmol L -1copper int o the liquid mediu m f or 6days .Ac 2cording t o the sequence of the laccase gene of the G 1lucidum fr om Gen Bank,an 879bp sequence,which w
7、as the 5ter m inal se 2quence of the laccase gene of G 1lucidum HG,was obtained .Then an 832bp p r omoter sequence on the up strea m of the initiati on codon in laccase gene of the G 1lucidum HG was a mp lified thr ough a self 2f or med adap t or PCR (SEF A 2PCR method .The p r omoter was analyzed u
8、sing the Softberry s oft w are .The result showed that,besides s ome basic transcri p ti on initiati on ele ments,such as T AT A 2box,CAAT 2box and GC 2box,s ome other potential cis 2acting ele ment sequence sites als o existed,including f ourMRE,four STRE,eleven HSE and five nitr ogen fact or bindi
9、ng sites,etc .Key wo rd s:Ganoder m a lucidum ;laccase;se m i 2quantitative RT 2PCR;self 2f or med adap t or PCR (SEF A 2PCR ;transcri p ti onal regulati on漆酶(laccase,EC l 1101312是一类含铜的多酚氧化酶,主要分布于植物、高等真菌、细菌及昆虫中1。漆酶能够催化多种酚型和非酚型底物氧化,同时伴随将分子氧还原成水1。由于漆酶还被广泛应用于环保、废水处理、纸浆漂白、生物免疫检测以及发酵等工业上2,因此,关于漆酶高产菌株的筛选及
10、其表达调控的研究成为目前国际上酶工程学和环境科学交叉领域研究的热点。灵芝(Ganoder m a lucidum 是一种重要的药用真菌,在临床上主要用于治疗慢性支气管炎、神经衰弱、冠心病、肝炎等疾病,由于其特殊的药用价值,对灵芝有效成分的分析及药理作用的研究已引起了收稿日期:2007-11-23基金项目:国家自然科学基金项目(30571294,30300006;江苏省自然科学基金创新人才项目(BK2006517作者简介:欧阳翔,硕士研究生。3通讯作者:赵明文,副教授,从事食药用真菌应用与遗传研究,E 2mail:mwzhaonjau 1edu 1cn 。国际上的关注。漆酶作为白腐真菌中重要的一
11、类酶,对白腐类真菌的变色、子实体的形成、致病性等有着极为重要的作用3。但是,对灵芝中漆酶的研究主要还停留在酶学初步水平,如不同外源培养条件对灵芝漆酶酶活性及产量的影响等,而对灵芝漆酶基因水平的表达调控研究目前还没有相关报道。外界培养条件不同对真菌漆酶的表达有着重要的影响作用。研究表明,漆酶的表达会受到包括无机重金属离子,碳、氮源等营养元素,以及芳香族化合物等不同外源培养物的影响,而且这些因素诱导漆酶的上调表达都会发生在基因转录水平4-7。在所有的这些诱导物中,又以Cu 2+对不同真菌漆酶的诱导效果最明显3,8-9。由于基因转录主要受转录模板上游启动子及其相关的顺式作用元件调节10,而且目前的研
12、究也表明,在漆酶基因的5端转录调控区域确实存在对应于不同外源诱导物的潜在结合元件,因此,克隆并且利用这样一个可以调控表达的启动子,是构建可调控灵芝遗传转化体系的重要基础。本研究报道了灵芝漆酶的同工酶基因受金属Cu 2+诱导表达的转录特性,并通过对其5端转录调控区的克隆和结构分析,初步探讨了其结构与漆酶基因转录表达的内在关系,为在灵芝中构建一个Cu2+诱导型表达载体系统提供重要依据。1材料与方法111菌株和质粒灵芝(Ganoder m a lucidum 菌株HG 、大肠杆菌DH5由本实验室保存;pMD18-T 载体购自大连TaKaRa 公司。112培养基和试剂液体培养基为P DA 培养基;Ta
13、q 酶、LA 2Taq 酶、T 4DNA 连接酶、DNase 酶、M 2MLV 反转录酶、Triz ol 试剂盒等均购自大连TaKaRa 公司;其余试剂为进口或国产分析纯。113灵芝菌丝的C u 2+诱导处理以硫酸铜作为漆酶基因转录表达的Cu 2+诱导剂,对灵芝菌丝进行诱导处理分析。浓度诱导:将灵芝接种于Cu 2+终浓度为015、110、210、310、410、510mmol L -1的P DA 培养基中,进行不同浓度的Cu 2+诱导处理,处理时间为7d,同时设不加Cu 2+的处理作为空白对照。时间诱导:以经浓度诱导分析得出的最佳作用浓度310mmol L -1为终浓度,分别于灵芝菌丝培养1、
14、2、3、4、5、6、7d 将Cu 2+加入到灵芝摇瓶发酵液中,进行不同时间诱导分析,同时设不加Cu 2+的处理作为空白对照。收集各处理菌丝,于-70冰箱冻存,备用。114基因组DNA 和总RNA 的制备灵芝菌丝体的培养按照Zhao 等11的方法进行。灵芝总DNA 的提取:收集培养7d 的灵芝菌丝,用液氮速冻并研磨成粉后,采用CT AB 法提取。灵芝总RNA 的提取:取经不同浓度和不同时间Cu 2+诱导后的灵芝菌丝,在液氮速冻研磨粉碎后,按照TaKaRa 公司的Triz ol 试剂盒说明书进行操作。115半定量R T 2PCR 及产物检测使用O ligo (dT 17和M 2MLV 反转录酶对经
15、DNase 酶处理的总RNA (1g 进行反转录,合成第1链c DNA 。根据灵芝中已知的c DNA 序列(AY485829,设计1对引物RT1(52GCCTGT CGCCAACCT 2CACCA 23和RT2(52AACG AGTTCCCACTG ACG AT 23;同时,以灵芝GP D 基因为内参12,设计1对引物GP D1(52CT CCTTCACGG AG ACATT 23和GP D2(52T AACACCGCAG ACG AACA 23进行竞争性RT 2PCR 检测,总体系为25L 。PCR 反应参数为:943m in;9430s,5430s,7245s,30个循环;725m in
16、。扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳分离,其相对含量用B i oRad 公司的Quantity One 软件进行分析。116灵芝漆酶基因DNA 的获得根据灵芝中已知的c DNA 序列(AY485829,设计1对引物P1(52ATGGCCAG ACTT CAAT CCTTT 23和P2(52CAGGCTGGGT CTGGCAAT 23,以灵芝基因组DNA 为模板进行PCR 扩增。PCR 反应体系为:10×PCR Buffer 215L,25mmol L -1MgCl 2115L,215mmol L -1dNTPs 215L,20mol L -1P11L,20mol L -1P21L,1U
17、Taq DNA 聚合酶,基因组DNA 1L,总体系25L 。PCR 反应参数为:943m in;9430s,5230s,721m in,35个循环;725m in 。PCR 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,回收并克隆到p MD18-T 载体上,筛选阳性克隆,送上海生工生物工程技术服73第1期欧阳翔,等:灵芝漆酶基因转录Cu 2+诱导特性及其启动子的克隆与序列分析务有限公司测定插入片段序列。117S EFA 2PCR 法克隆漆酶基因启动子根据已获得的灵芝基因组DNA 序列,参照W ang 等13的方法,设计引物Sp1(52TGGT ATT ATCAG 2T ATCAGGGGT AGTGGC 23、
18、Sp2(52T AG ACAT AACGGG AAT AAATCAT ACAAT AC 23和He m i 2Sp3(52GTTGCCAGTT ATG AGG NNNNNNNNNG AG AC 23,以灵芝基因组DNA 为模板进行PCR 扩增。SEF A 2PCR 扩增第1步反应体系为:2×GC Buffer 15L,215mmol L -1dNTPs 5L,5mol L -1He m i 2Sp32L,LA 2Taq 115U ,012g L -1灵芝总基因组DNA 1L,总体系30L 。PCR 反应程序为:941m in,9430s,373m in,以012s -1的速度升至70
19、,705m in 。反应结束后,取出PCR 管加入5mol L -1Sp12L 后继续进行PCR:9430s,65515m in,共25个循环;然后在9430s,65515m in,9430s,65515m in,9430s,5030s 条件下运行8个循环。SEF A 2PCR 扩增第2步反应体系为:2×GC Buffer 15L,215mmol L -1dNTPs 5L,5mol L -1Sp22L,LA 2Taq 115U ,第1步PCR 反应产物115L,总体积30L 。PCR 反应程序为:943m in;9430s,5830s,725m in,33个循环;7210m in 。
20、PCR 扩增产物经115%琼脂糖凝胶电泳,回收并克隆到p MD18-T 载体上,筛选阳性克隆,送上海生工生物工程技术服务有限公司测定插入片段序列。所得的序列用启动子分析软件Softberry 进行分析14。2结果与分析211灵芝漆酶基因转录的诱导RT 2PCR 结果分析表明,灵芝漆酶基因在Cu 2+诱导下转录表达量出现明显差异。不同浓度Cu 2+对灵芝漆酶基因的转录表达作用是不同的,其中以310mmol L -1Cu 2+诱导时漆酶mRNA 的水平最高,随着发酵液中Cu 2+浓度的升高,漆酶基因的转录受到明显的抑制(图1-a 。Cu 2+的不同作用时间对漆酶的转录表达作用也不同,以310mmo
21、l L -1Cu 2+水平诱导6d 的作用效果最佳(图1-b ,转录表达量是未诱导的516倍 。图1C u 2+诱导下灵芝漆酶基因m RNA 转录的R T 2PCR 产物电泳检测结果F i g 11R T 2PCR ana l yse s o f the exp re ss i o n o f Ga no de r m a l uc i dum l acca se gene unde r the i nduc ti o n o f C u2+a .17分别为0、015、110、210、310、410、510mmol L -1Cu 2+诱导的结果。The results induced by 0
22、(lane 1,015(lane 2,110(lane 3,210(lane 4,310(lane 5,410(lane 6and 510mmol L -1(lane 7Cu 2+.b .18分别为310mmol L -1Cu 2+作用时间为0、1、2、3、4、5、6、7d 的结果。The results induced by 310mmol L -1Cu 2+after dealing with 0(lane 1,1(lane 2,2(lane 3,3(lane 4,4(lane 5,5(lane 6,6(lane 7and 7d (lane 8.212灵芝漆酶基因DNA 序列的PCR 扩增
23、通过PCR 扩增和电泳检测,在约800bp 处得到一明显单一条带(图2。经测序、B last 比对分析表明,所得片段的序列确实为灵芝漆酶基因DNA 序列,大小为879bp 。213灵芝漆酶基因启动子的PCR 扩增根据已得到的灵芝漆酶基因DNA 序列设计引物Sp1、Sp2和He m i 2Sp3,以灵芝总基因组DNA 为模板向上游进行SEF A 2PCR 扩增。经过两步扩增后得到一约112kb 大小的条带(图3。将该条带回收、测序。经序列比对后发现,所得序列与已获得的灵芝漆酶基因DNA 序列有340bp 的重叠,表明所得序列即为灵芝漆酶基因的启动子序列,大小为832bp 。214灵芝漆酶基因启动
24、子序列分析利用Softberry 网站的Recogniti on of Regulat ory Motifs with Statistic 数据库对克隆得到的灵芝漆酶基因启动子序列进行分析。结果表明(图4,在所克隆的灵芝漆酶启动子序列中,包含真核生物启动子的基本转录调控元件:3个T AT A 2box 分别位于起始密码子上游第-86、-422和-625位,4个CAAT 2box83南京农业大学学报第32卷 图2灵芝漆酶基因DNA 的PCR 扩增产物电泳结果F i g 12The p r o duc t o fG 1l uc i dum l a cca se gene byPCR1.灵芝漆酶基因
25、DNA 片段The frag ment of G 1lucidumlaccase gene;M.DNA 标准DNA marker 图3SEFA 2PCR 法扩增灵芝漆酶基因启动子电泳结果F i g 13The p r o duc ts o f G 1l uc i dum l acca se p r om o te r reg i o n by SEFA 2PCR 1.第1轮扩增结果The first PCR p r oduct; 2.第2轮扩增结果The second PCR p r oduct;M.DNA 标准DNA marker分别位于第-159、-386、-506和-525位,以及1个G
26、C 2box 位于第-66位。另外在灵芝漆酶的启动子序列中还存在许多潜在的外源诱导物响应结合元件,包括:4个遵循TGCPuCXC 序列15的金属响应元件MRE,分别位于第-437、-452、-520和-612位;4个潜在的压力响应元件STRE (CCCCA /GGGGT 16,分别位于第-64、-669、-684和-823位;11个潜在的热激响应元件HSE (NG AAN 15分布在启动子的第-53-680区域;以及5个氮因子结合位点(G AT A /T AT C 17,分别位于第-33、- 164、-326、-705和-737位。图4灵芝漆酶基因启动子序列及其结构F i g 14The se
27、que nce and s truc tu re o fG 1l uc i dum l a cca se p r om o te r以ATG 起始密码子的第一个核苷酸计为+1。Nuckotides are numbered by assigning positi on +1t o the first base of the ATG codon .3讨论Cu 2+是漆酶蛋白的结构组成成分,它能有效提高多种真菌漆酶同工酶产量1。定量RT 2PCR 结果表明,灵芝漆酶基因的转录水平受到Cu 2+诱导的影响,其表达量与Cu 2+的作用时间及浓度呈现一定的正相关性。分析克隆得到的灵芝漆酶基因的5端调控区
28、域,除含有真核生物启动子转录的基本元件T AT A 293第1期欧阳翔,等:灵芝漆酶基因转录Cu 2+诱导特性及其启动子的克隆与序列分析04南京农业大学学报第32卷box、CAAT2box以及GC2box外,还分析到4个与高等真核生物金属硫蛋白基因启动子中序列一致的金属离子效应位点(MRE,MRE对金属硫蛋白基因响应重金属离子的诱导起着至关重要的作用。Cul otta 等15证实,启动子序列中插入有小鼠金属硫蛋白基因金属离子效应位点MRE的氯霉素乙酰转移酶基因,仅单拷贝就能够使氯霉素乙酰转移酶基因在诱导后表达量增加34倍;Collins等4在Tram etes ver2 sicolor中也证实
29、,在不含有Cu2+的培养基中加入Cu2+,15m in内就能检测到漆酶基因转录水平的增加。灵芝漆酶基因的转录水平随着发酵液中Cu2+处理浓度和时间的变化而变化,说明灵芝漆酶基因5端调控区存在的4个MRE序列可能具有一定的生理意义,进一步的证据有待于对其5端调控区域进行缺失分析研究。另外,在灵芝漆酶的5端调控区域,还分布有4个潜在的压力响应元件(ST RE和11个潜在的热激响应元件(HSE。Faraco等18在酵母中的研究证明,HSE能够强烈感受外界热刺激而激活金属硫蛋白基因的转录,因而STRE和HSE可能会共同响应高浓度Cu2+的压力而激活灵芝漆酶基因的转录。Marzluf等17的研究也表明,
30、在粗糙脉孢菌、酵母等真菌中,特异的氮因子结合元件(G AT A能够激活氮结构基因的转录,而我们在所克隆的灵芝漆酶启动子序列上也分析到有5个潜在的氮因子结合位点,这说明灵芝漆酶基因还可能受到氮源的调控。灵芝漆酶基因5端转录调控区域多个重要的潜在顺式作用元件的存在,对应了摇瓶发酵的漆酶表达规律,为进一步揭示漆酶表达调控的分子机制奠定了基础;同时,也为Cu2+诱导型表达载体系统的构建提供了重要依据。参考文献:1Ko E2M,Lee m Y2E,Choi H T.Purificati on and characterizati on of laccase is ozy mes fr om the wh
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