榄香烯联合生物大分子合成抑制剂对Hca-F肝癌的作用(1)

1、    榄香烯联合生物大分子合成抑制剂对Hca-F肝癌的作用(1)    】 目的 本实验采用榄香烯与生物大分子合成抑制剂联合处理小鼠肝癌细胞Hca-F，观察肿瘤细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制/干扰肿瘤细胞的DNA、RNA或蛋白质合成对榄香烯抗瘤作用的影响，以期为判断榄香烯作用的可能靶点提供线索与依据。方法 将Hca-F肝癌细胞用榄香烯（50g/ml）、吡柔比星（THP）（10mol/ml）、单独和复合处理，设单独瘤细胞（不处理）为阴性对照。Hca-F细胞浓度均为1×106/ml，每个观察时间点均

2、设3支复管，用台盼蓝拒染法计算细胞存活率，在透射电镜下观察榄香烯与THP联合处理对肿瘤细胞超微结构的影响，用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果 榄香烯联合吡柔比星处理Hca-F比单独使用两种药物的抑瘤率都高。结论 本实验所用生物大分子合成抑制剂不能阻断榄香烯的抗瘤作用，提示榄香烯抗肿瘤作用对新的蛋白质表达依赖性较低。结合榄香烯处理后瘤细胞形态学的变化，提示榄香烯可能作用于肿瘤细胞膜或细胞中的某些蛋白质（如酶）等而直接杀伤肿瘤靶细胞，使对榄香烯抗瘤作用靶点的认识又进了一步。本实验结果表明榄香烯和THP合用可使抗癌作用增强，这对榄香烯联合其他药物治疗肿瘤可能有一定参考意义。 

3、0;      【关键词】 榄香烯；抑制剂；肝细胞癌    The effect of elemene combined with inhibitors of macromolecular synthesis for hepatic cancer【Abstract】 Objective In this experiment of Hca-F cells (a murine hepatic cell carcinoma) were treated with elemene combined wit

4、h inhibitors of macromolecular synthesis， their proliferation， survival， cell cycle， apoptosis and morphology were observed. To clarify the influences of inhibition of DNA， RNA and protein on the antitumor effects of elemene and to find the possible target site of elemene.Methods The Hca-F cells wer

5、e singled or mingled treated with elemene（50g/ml），alone or combined with THP （10mol/ml）， the Hca-F cells(without treatment) were used to be the negative compare. The end consistence of Hca-F cells is 1×106/ml， three tubles in every time point. To calculate the proportion of

6、survival with trypanblue， and observe the impact on the ultrastructure of Hca-F cells treated with elemene and THP in transmission electron microscope， and examine the apoptosis and cell cycles in flow cytometer. Results The inhibition rate of proliferation of Hca-F treated with elemene and THP was

7、higher than that of Hca-F treated with elemene only.Conclusion These results showed that the antitumor effects of elemene could not abolished by combined treatment or pretreatment with the inhibitors of DNA， RNA， protein synthesis， which suggest that the antitumor effects of elemene may be

8、 independent on their synthesis. Combined usage of elemene with THP to cancer therapy is advisable.     【Key words】 elemene；inhibitor；hepatocellular carcinoma        榄香烯(elemene)是从中药温莪术（经鉴定为我国特有新种定名为温郁金，Curcuma Wenyujin）挥发油中提取的抗癌有效成分，它是一种仅含

9、碳氢(C15H24)，分子量只有204的小分子、脂溶性的倍半萜类化合物， 此类物质有抗癌活性属我国首报1。动物实验与临床应用均表明榄香烯的抗癌作用确切，而且不良反应很低。我们过去的研究表明榄香烯处理除可抑制肿瘤细胞增殖、诱导其凋亡外，还能增强肿瘤细胞的免疫原性，榄香烯处理能增强肿瘤细胞膜HSP70的表达，用表达谱基因芯片技术的研究表明榄香烯处理引起基因表达谱的变化。过去对榄香烯抗癌作用机制的研究仅限于榄香烯对肿瘤细胞增殖、分化和凋亡、免疫原性等的影响，关于它的作用靶点及其信号传导通路迄今研究很少。本实验在上述研究的基础上，采用榄香烯与生物大分子合成抑制剂联合处理小鼠肝癌细胞Hca-F，观察肿瘤

10、细胞增殖、凋亡和形态学的变化，探讨抑制或干扰肿瘤细胞的DNA、RNA或蛋白质合成对榄香烯抗瘤作用的影响，以期为判断榄香烯作用的可能靶点提供线索与依据。        1 材料与方法        11 动物 Balb/c系小鼠，引自中国医学科学院北京药物研究所，由本室自行繁殖提供。        12 瘤株 小鼠腹水型肝癌H22的高淋巴道转移亚系Hca-F2

11、，由本校病理学教研室凌茂英教授赠送，本室常规传代、保种。    1.3 主药品和试剂 1%榄香烯注射液(elemene，大连市医药科学研究所 )。吡柔比星(Pirarubicin，THP，深圳万乐药业有限公司生产)。RPMI1640培养基（GIBCO，USA）。        1.4 Hca-F细胞悬液的制备 将传代保种的Hca-F腹水型肝癌细胞常规接种于小鼠腹腔，0.2ml/只，收集第78天的腹水（肿瘤细胞生长最旺盛时期，死亡细胞和红细胞含量较少），HS液破除红细胞，PBS

12、 洗3次，计活细胞数，用含20%小牛血清RPMI1640培养液调细胞数至所需浓度。        1.5 Hca-F肝癌细胞的处理 将Hca-F肝癌细胞用榄香烯（50g/ml）、吡柔比星（10mol/ml）按本室常规方法单独或复合处理，设单独瘤细胞（不处理）对照。Hca-F细胞浓度均为1×106/ml，每个观察时间点均设3支复管，加入相应的药品，以台盼蓝拒染法于不同时间计数活细胞数，计算存活率。        1.6 单纯榄香

13、烯处理和榄香烯联合THP处理对Hca-F增殖的影响 用MTT法测其OD值。        1.7 榄香烯联合THP处理对瘤细胞超微结构的影响3 Hca-F细胞用榄香烯、THP单一或复合处理，细胞浓度和处理方法同前，处理时间为1h，收细胞，用PBS洗3次，以2.5%戊二醛固定，常规包埋制片，铀铅双染色，透射电镜下观察摄片。        1.8 细胞凋亡的检测和细胞周期的测定 细胞收集同前，用PBS洗3次，加入 PI染色液染色30min（

14、避光、室温）。上机检测，Cellquest软件低速获取。用Modfit2.0软件分析。            作者:郭连英，陈 骏，沈 洁，邢 嵘1，施广霞，钱振超【摘】目的本实验采用榄香烯与生物大分子合成抑制剂联合处理         本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您

15、的合法权益，请联系我们。        2 实验结果        2.1 榄香烯联合THP处理对Hca-F存活的影响 单纯用榄香烯处理，Hca-F的存活率就明显降低，在30min1h的时间内，细胞死亡率随着药物浓度增加而增加（表1），单用THP处理，也可导致Hca-F细胞死亡、蓝染，其细胞死亡率也随着药物浓度增加而增加，榄香烯联合THP处理，肿瘤细胞死亡率可达100%。表1 榄香烯单独或联合THP处理对Hca-F细胞存活的影 

16、;   2.2 榄香烯和THP联合处理对Hca-F细胞周期与凋亡的影响 实验结果表明榄香烯与THP联合处理对Hca-F细胞周期变化的影响及凋亡细胞百分率变化与单用THP相比也无明显区别， 榄香烯处理与不处理Hca-F对照组细胞各时相百分率及凋亡细胞百分率变化无明显区别（见表2和图1）。    表2 榄香烯联合THP处理对Hca-F细胞周期与凋亡的影响    2.3 榄香烯联合THP处理对Hca-F细胞形态学的影响 见图2。图2可示：当榄香烯与THP联合处理的肿瘤细胞形态发生了明显的变化

17、，细胞核染色质浓缩，核缩小，细胞肿胀破裂，细胞完整性受到明显破坏，而单纯用THP处理的30min内大多数没有明显改变，受损细胞形态学变化不典型，偶可见到凋亡、坏死的细胞，但比率并不高。图1 A： 对照组；B： 榄香烯50g/ml；C： THP 10mol/ml；D： 榄香烯50g/ml联合THP10mol/ml对Hca-F细胞周期影响的流式细胞仪分析结果图1 流式细胞仪分析结果A：THP 10mol/ml；B：榄香烯50g/ml联合THP10mol/ml；C： 对照组；D： 榄香烯50g/ml图2 榄香烯联合THP处理对后Hca-F细胞的形态学改变    

18、;3 讨论大连医科大学病理生理学教研室和肿瘤生物治疗研究所从20世纪70年代起就开展了莪术油、榄香烯抗癌作用的机理研究35。结果表明榄香烯处理能诱导肿瘤细胞坏死、凋亡，增强肿瘤细胞的免疫原性。为了阐明后者与榄香烯诱导肿瘤细胞膜热休克蛋白（heat shock protein，HSP）表达之间的关系7，我们采用流式细胞术（FCM）、免疫组化、RTPCR以及基因芯片等技术进行了较深入的研究，结果表明，榄香烯处理能增强肿瘤细胞膜HSP70的表达，但不增强HSP70基因的转录，提示这仅仅涉及HSP分布的改变。为较准确展现可能与榄香烯抗癌作用有直接关系的基因表达变化，我们用榄香烯（浓度为50g /ml，

19、作用时间1h） 处理人肝癌细胞HepG2，用表达谱基因芯片（Affymetrix， Human Genome， U95A Part#， 510448， Lot# 9913250-9913251，U.S.A.，其上有12550条寡聚核苷酸）技术研究了榄香烯处理引起基因表达谱的变化并与未经榄香烯处理的和热休克的HepG2细胞对比，有34条基因表达发生变化，19条基因变化是榄香烯特异的，如肝特异转录因子HNF-6转录增加，肝再生因子（LRF）的基因表达下降，细胞周期调控因子CDC25Hu2的基因表达降低，凋亡相关分子BBC3、TRIP 的基因表达下降等，采用RT-PCR方法验证了BBC3和TRIP基

20、因的变化6。        本实验在上述研究工作的基础上研究了榄香烯联合生物大分子合成的抑制剂对Hca-F的增殖、存活、凋亡、细胞周期及形态学改变的影响。结果表明本实验所用三种生物大分子合成抑制剂都不能阻断榄香烯的抗瘤作用。THP可嵌入DNA双链中，抑制DNA聚合酶的活性，从而抑制DNA的复制与转录。拓扑替康能够抑制拓扑异构酶，从而抑制DNA复制。两药都不能阻断榄香烯的抗瘤作用。放线菌酮是真核细胞蛋白质合成的抑制剂，能特异阻断蛋白质的合成，许多实验常用放线菌酮预处理观察药物作用及细胞代谢、功能、凋亡等过程对新的蛋白

21、质生物合成的依赖性7。放线菌酮预处理并不能阻断榄香烯对Hca-F细胞增殖的抑制作用，表明榄香烯抗肿瘤作用对新的蛋白质表达依赖性较低。结合榄香烯处理后瘤细胞形态学的变化，提示榄香烯作用于肿瘤细胞膜或细胞中的某些蛋白质（如酶）等直接杀伤肿瘤靶细胞。由于榄香烯分子小，抗癌作用比较独特，尤其是不与其他抗癌药有交叉耐药性，与其他抗癌药联合应用是值得探讨的问题。本实验结果表明榄香烯和拓扑替康、THP合用可使其抗癌作用增强，这对榄香烯联合其他药物治疗肿瘤可能有一定参考意义。【参考文献】    1 时继慧. 温莪术挥发油的实验研究榄香烯抗肿瘤作用的研究.中药通报，1981，6：32.        2 凌茂英. 小鼠肝癌（Hca）两株克隆细胞系