低氧诱导因子1α在大鼠胶原诱导性关节炎中的表达及与血管生成的关系

1、低氧诱导因子1在大鼠胶原诱导性关节炎中的表达及与血管生成的关系         11-01-12 16:30:00     编辑：studa20              作者：王雯 陈森洲  徐雅娟  刘菁  陈建宏  钟毓娟【摘要】  目的 制备牛型胶原诱导性大鼠关节炎(CIA)模型，探讨低氧诱

2、导因子1(HIF1)、血管内皮生长因子(VEGF)在类风湿关节炎(RA)组织中的动态表达及其相关性作用。方法 50只SD大鼠，随机分为对照组与模型组。建立CIA模型，动态观察各项关节炎活动指标，于造模21、28、35、42 d取踝关节行HE染色及HIF1、VEGF免疫组化染色，分析两者在CIA中的相关性及与关节炎活动指标、滑膜病理学评分之间的关系。结果 CIA大鼠关节滑膜层和滑膜下层均表达HIF1、VEGF，第21天阳性表达量最高，随病程进展，表达逐渐下降，与滑膜病理学评分、滑膜增生评分及血管生成评分呈显著正相关，与炎症浸润评分无明显相关。结论 型胶原可成功诱导大鼠关节炎模型。HIF1、VEG

3、F在RA组织中的表达,与炎症严重程度呈明显正相关。HIF1可能通过调控一系列下游靶基因，如VEGF等，促进滑膜增生及血管生成，影响RA的发生、发展。 【关键词】  型胶原诱导性关节炎;低氧诱导因子1;血管内皮生长因子;滑膜【Abstract】 Objective To establish the bovine collagen(C)induced arthritis (CIA) rat model and investigate the role of hypoxiainducible factor1(HIF1) and vascular endothelial growth fac

4、tor (VEGF) in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA). Methods 50 SD rats were randomly divided into normal and model group. The arthritis activity, pathological changes and expression of HIF1 and VEGF on synovium at different time were observed through HE and immunohistochemistry staining. Th

5、e correlations of HIF1 and VEGF expression with the CIA arthritis activity indexes and pathological scores were analyzed. Results HIF1 and VEGF expressions were found on both lining and sublining area of synovium in CIA. The results of immunohistochemistry test showed that the expression of HIF1 and

6、 VEGF in synovial membrane was strongest on the 21st day, descent gradually with the prolonged disease course. The expression of HIF1 and VEGF correlated significantly with total pathological score, synovial hyperplasia score and angiogenesis score, but not with inflammation score. Conclusions Type

7、collagen can induce arthritis in rats successfully. HIF1 may affect the pathogenesis of RA by promoting synovial hyperplasia and angiogenesis and regulating the lower course target genes just as VEGF.【Key words】 Rheumatoid arthritis; Collagen induced arthritis; Hypoxiainducible factor1 ; Vascular en

8、dothelial growth factor; Synovium类风湿关节炎(RA)是一种以慢性、对称性、多关节炎症为主要表现的自身免疫性疾病，其病因和发病机制迄今尚未明确。RA主要病理改变为滑膜炎，滑膜细胞的类肿瘤样增殖和大量炎症细胞的浸润，造成一个低氧微环境。低氧诱导因子1(HIF1)是介导细胞对缺氧微环境适应反应的关键性调控因子。研究发现，有核细胞缺氧时，均可引发HIF1的高表达1。新生血管形成是造成滑膜炎、血管翳、关节破坏发生发展的一个重要环节，血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现的最强有力促血管生成因子，直接参与新生血管形成。在RA中VEGF能够促进滑膜血管翳的形成、加重滑膜炎症

9、及骨与关节软骨的破坏。本实验以大鼠型胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)为模型，研究HIF1在CIA中的表达及与新生血管生成之间的关系，初步探讨HIF1在RA发病过程中的作用及与VEGF之间的关系，有助于了解HIF1对于RA发生发展的调控作用。1 材料与方法1.1 实验动物和试剂 雌雄各半健康SD大鼠50只(体重150180 g)，动物级别：清洁级(SPF)，由本院动物中心提供，动物许可证号：SCXK桂20070001，购入本实验室适应性饲养1 w后进行实验。随机分为正常对照组，四个造模组，每组按照随机方式110进行编号。牛型胶原(美国Chondre

10、x公司);不完全弗氏佐剂(IFA，美国Sigma公司);HIF1单克隆抗体(美国Chemicon公司);VEGF单克隆抗体(美国Santa Cruz公司);二抗试剂盒(福州迈新公司)。1.2 动物模型及关节标本制作 按照文献提供的方法稍加修改建立型胶原诱导型关节炎大鼠模型2，牛型胶原和IFA按11充分乳化成终浓度为1 g/L乳剂。分45点在大鼠尾根部、背部皮内注射0.5 ml，对照组注射同量生理盐水，7 d后同法半量加强免疫一次。四个造模组大鼠分别于初次免疫后第21天、第28天、第35天、第42天处死;对照组大鼠于注射生理盐水后第42天处死。处死后大鼠取踝关节，乙二胺二乙酸(EDTA)脱钙23

11、 w后，石蜡包埋、切片，行HE染色，SP免疫组织化学法检测HIF1、VEGF蛋白的表达。1.3 观察指标1.3.1 大鼠一般状况及体重测定 造模前后动态观察大鼠体重、毛发色泽改变、神志、活动状态，食量变化及关节红肿情况，每周定期测量大鼠体重。1.3.2 关节炎指数3(AI) 根据大鼠踝关节、跖趾关节、趾关节红肿程度及受影响关节数进行评分。0分：正常;1分：1个关节红肿;2分：2个及2个以上关节红肿;3分：踝关节以下足掌严重红肿;4分：包括踝关节在内的全部足爪红肿且不能负重。四肢分别进行评分，总和即为AI。AI>5分为造模成功。1.3.3 踝关节影像学观察 初次免疫后第21天、第42天经1

12、%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，行踝关节X线摄片。摄片条件为40 kV。1.3.4 免疫组织化学染色结果判定及评分 采用半定量记分法判定：按阳性着色程度评分。0分为无着色，与背景色一致;1分为浅黄色，略高于背景色;2分为棕黄色，明显高于背景色;3分为棕褐色。按阳性细胞所占比例评分。0分为阴性;1分为10%以下;2分为11%50%;3分为51%75%;4分为75%以上。两者乘积判定阳性结果。HIF1阳性细胞为胞浆或胞核呈棕黄色或棕褐色，VEGF阳性细胞为胞浆呈棕黄色或棕褐色。1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行处理，正态分布资料用x±s表示;多组间均数的比较采用单因素方差分析;半定量资料两组间比较采用MannWhitney秩和检验;对两组数据间的相关性进行Spearman等级相关分析。2 结 果2.1 大鼠CIA模型的建立 模型组40只大鼠在首次给药后第12天起，有26只出现踝