hREV3基因表达被反义阻断的人胚肾细胞系的建立及其某些生物学特性观察

1、    hREV3基因表达被反义阻断的人胚肾细胞系 的建立及其某些生物学特性观察        摘要目的：建立hREV3基因表达反义阻断的细胞系并观察其生长特性与对烷化剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)敏感性的改变。方法：利用改良磷酸钙-DNA共沉淀法分别将本室构建的持续和诱导表达反义hREV3 RNA的真核细胞重组表达质粒pBK-RSV-hREV3和pMAMneo-amp-hREV

2、3?转染人胚胎肾细胞(HEK-293细胞)，经G418筛选，建立相应的细胞系293-B-hREV3-和293-M-hREV3?。通过细胞计数方法观察这些细胞系的生长速率和不同浓度MNNG对细胞的细胞毒作用。 结果：持续或诱导阻断hREV3基因的表达对细胞生长速率均无影响；反义阻断细胞系对MNNG的细胞毒作用比母本293细胞较为敏感。结论：hREV3基因的编码产物并非细胞生长所必需而可能在细胞的DNA损伤修复中起作用。 主题词基因；RNA，反义；细胞系；DNA，修复；烷化剂中分类号Q753文献标识码A文章编号1000-4718(2000)04-0293-05 Establishment of c

3、ell lines whose hREV3 gene expression was inhibited by transfection of antisense RNA expression plasmids and their biological characteristicsXU Fang, YU Ying-nian, SONG Tao(Department of Pathophysiology, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310031, China)AbstractAIM：To establish the cell

4、 lines whose hREV3 gene expression was blocked by antisense RNA and observe their characteristis of cell growth rate and N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) sensitivity.METHODS:With modified calcium phosphate-DNA coprecipitation method the eukaryocytic expression plasmid expressing antis

5、ense fragment of hREV3, pBK-RSV-hREV3? and pMAMneo-amp?hREV3? were transfected into human embryo kidney cell line of HEK-293. After G418 selection ,cell lines of 293-B-hREV3? and 293-M-hREV3? were established. By cell counting method, the cell growth rate and MNNG sensitivity of these cell lines wer

6、e characterized.RESULTS:No change of cell growth rates of these cell lines was observed whether hREV3 gene expression was blocked by either the persistent or induced expression of the antisense hREV3 RNA. While the sensitivity of these cell lines to MNNG was somewhat elevated ,as compared with their

7、 parent cell line 293 and the cell lines transfected with vector DNAs.CONCLUSION:The gene product of hREV3 was not essential for the cell growth, but it may play a role in the DNA repair functions of the cells after exposure to DNA damaging agents.MeSHGenes; RNA, antisense; Cell line; DNA, repair; A

8、lkylating agents真核细胞DNA聚合酶(DNA polymerase, pol) (pol )是近年在酵母的突变修复通路研究中发现的，它是由REV3与REV7紧密结合形成的蛋白复合物，无35外切酶活性，而具有DNA跨损伤修复活性(效率达10%，而pol 只有1%)，参与真菌易误的复制后修复/诱变修复(error prone PRR/mutagenesis repair)通路1，2。跨损伤修复避免了细胞因模板链碱基损伤而导致DNA复制的永久性停止，但由于在聚合反应中的插入偏倚(insertion bias)却诱发了突变。REV3基因发生突变的酵母菌表现出自发突变率和诱发突变率的下降

9、1，3。人pol 同源基因(hREV3基因)在1998年被克隆和鉴定，由于它与真菌的REV3基因高度同源，因此推测在功能上也可能相似。目前已发现它在肿瘤中有高表达4。建立诱导和持续表达反义hREV3 RNA的人源细胞系将为研究hREV3基因及其编码产物与遗传不稳定的形成和基因突变的发生的关系奠定基础。本文报告这些细胞系的建立及对它的某些生物学特性的观察结果。材料和方法一、实验材料(一)真核表达载体和反义重组质粒真核细胞持续表达载体pBK-RSV购自Stratagene公司，诱导表达载体pMAMneo-amp?由本室从pMAMneo(Clontech公司)改建而得5；持续和诱导表达的反义重组表达

10、质粒pBK-RSV-hREV3和pMAMneo-amp-hREV3-由本室构建6，后者在真核细胞中表达需地塞米松诱导。(二)细胞人胚肾传代细胞(HEK-293细胞)由美Georgetown大学医学院Wolfe博士提供，本室冷冻保存。二、实验方法(一) 表达反义hREV3 RNA的人胚肾细胞系的建立HEK-293细胞于37，5%CO浓度下贴壁生长于含10%胎牛血清(GIBCO)，100 kU.L-1青霉素，100 mg.L-1链霉素，200 mg.L-1卡那霉素的DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium)培养基(GIBCO)中。分别取20 g表达载体和反义重组表达

11、质粒的超螺旋DNA用改良磷酸钙-DNA共沉淀法7转染293细胞，在含400 mg.L-1G418的DMEM(GIBCO)全培养基中培养筛选，15 d左右即可看见克隆生长，继续使用含200 mg.L-1G418的培养基培养并扩大成系。(二)细胞系生长检测8用0.02% EDTA消化贴壁生长良好的细胞，按4×10细胞/孔密度接种于24孔培养板，取转染了反义表达质粒的细胞为实验组，以母本细胞和转染表达载体DNA的细胞系为对照组，每种细胞系设6组，每组4个复孔。在DMEM完全培养基(诱导表达组还需加10 mol*L-1地塞米松)37、5%CO条件下培养，每天作1组细胞计数，共6 d，根据计数

12、结果绘制细胞生长曲线，并按公式TT×log2/logNt-log No(其中T为培养时间、Nt为培养t时间时的细胞数、No为接种的细胞数)计算细胞群体倍增时间(TD)。(三)细胞系对MNNG敏感性检测90.02% EDTA消化贴壁生长良好的细胞，以1×10细胞/孔密度接种于24孔板，取转染了反义表达质粒的细胞为实验组，以母本细胞和转染表达载体DNA的细胞系为对照组，(诱导表达细胞系需加10 mol.L-1地塞米松诱导反义RNA表达)，37，5%CO培养24 h后，分别以含0，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1.0 mol.L-1浓度MNNG(Sigma)的无

13、血清DMEM培养基处理细胞45 min，每个浓度组3个复孔。MNNG首先溶于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中，新鲜配制，然后加至培养基中。DMSO在培养基中的终浓度皆固定为0.1%。处理结束后弃处理液，用Hanks液洗1遍，换新鲜DMEM完全培养基，37、5%CO条件培养4 d后，细胞计数。以MNNG 0浓度的计数结果为100，求出各MNNG浓度下的相对存活细胞数(%)。以它为纵轴，MNNG浓度(mol.L-1)为横轴，作出MNNG浓度对相对存活细胞数的剂量效应曲线。用MNNG浓度的对数进行直线回归并分别计算抑制细胞存活的半数抑制浓度(IC50)。结果一、细胞系的

14、获得经细胞转染及克隆筛选得到4个转基因细胞系即含持续表达载体pBK-RSV的细胞系293-pBK-RSV(以下简作293-B)和含诱导表达载体pMAMneo-amp-的细胞系293-pMAMneo-amp?(以下简作293-M)，以及相应的持续或诱导表达反义hREV3 RNA的细胞系293-pBK-RSV-hREV3?(以下简作293-B-hREV3?)和293-pMAMneo-amp-hREV3?(以下简作293-M-hREV3?)。二、细胞系生长曲线(见1，2)诱导阻断hREV3基因的细胞293-M-hREV3?与相应的对照组细胞293和293-M，在生长速率上无明显差异，细胞群体倍增时间

15、(TD)均为1.3 d；持续表达反义hREV3 RNA的细胞293-B-hREV3?与相应的对照组细胞293和293-B，在生长速率上也无明显差异，各细胞群倍增时间(TD)分别为：TD2931.7 d、TD293-B1.5 d 、TD293-B-hREV3-1.5 d。Fig 1Cell growth curve of cell line 293-M-hREV3?(-) whose hREV3 gene expression was inhibited by induced expression of its antisense RNA, as compared with the parent

16、 cell line 293(-) and cell line transfected with vector DNA 293-M(-)1hREV3 基因表达被诱导表达反义RNA所阻断的细胞系293-M-hREV3?(-)的生长曲线。与母本细胞系293(-)和转染了载体DNA的细胞系293-M(-)相比较Fig 2Cell growth curve of cell line 293-B-hREV3?(-) whose hREV3 gene expression was inhibited by persistent expression of its antisense RNA, as com

17、pared with the parent cell line 293(-) and cell line transfected with vector DNA 293-B(-)2hREV3基因表达被持续表达反义RNA所阻断的细胞系293-B-hREV3?(-)的生长曲线。与母本细胞系293(-)和转染了载体DNA的细胞系293-B(-)相比较三、细胞系的MNNG敏感性比较各细胞系在不同浓度MNNG作用后的相对成活细胞数见3和4。它们的半对数回归方程和回归系数以及它们的MNNG半数抑制浓度(IC50)则列于表1中。hREV3基因表达被反义阻断的细胞系(293-M-hTRV3?/293-B-hT

18、RV3?)的半数抑制浓度(IC50）的95%可信限区间与其相对应两对照组(母本细胞293和转染了载体DNA的细胞系293-M/293-B)的半数抑制浓度(IC50)95%可信限区间之间都不重叠，而hREV3基因表达被反义阻断的细胞系的半数抑制浓度(IC50)均低于相应的对照组，这表明hREV3基因表达被阻断的细胞系对MNNG的敏感性比对照组高。Fig 3MNNG sensitivity of cell line 293-M-hREV3?(-) whose hREV3 gene expression was inhibited by induced expression of its antis

19、ense RNA, as compared with the parent cell line 293(-) and cell line transfected with vector DNA 293-M(-)3诱导表达反义hREV3 RNA细胞系293-M-hREV3?(-)对MNNG的敏感性。与母本细胞系293(-)和转染了载体DNA的细胞系293-M(-)相比较Fig 4MNNG sensitivity of cell line 293-B-hREV3?(-) whose hREV3 gene expression was inhibited by persistent expressi

20、on of its antisense RNA, as compared with the parent cell line 293(-) and cell line transfected with vector DNA 293-B(-)4持续表达反义hREV3 RNA细胞系293-B-hREV3?(-)对MNNG的敏感性。与母本细胞系293(-)和转染了载体DNA的细胞系293-B(-)相比较表1hREV3基因表达阻断细胞系的MNNG浓度(x)与其相对存活数(y)间的回归方程和IC50Tab 1The regression lines of MNNG concentration(x) ve

21、rsus relative cell survival (y) of cell lines with different hREV3 gene expression and their IC50Cell linesRegression linesRegression coefficient95% confidence limits of IC50(mol/L)IC50(mol/L)293y-0.8707 lnx+3.7541R20.94340.28-0.200.24293-My-0.655 lnx+3.8955R20.96530.23-0.150.19293-M-hREV3-y-0.4991

22、lnx+3.8379R20.95950.13-0.070.10293y-0.7147 lnx+3.8134R20.99770.29-0.120.19293-By-0.9342 lnx+3.4002R20.96100.25-0.130.18293-B-hREV3-y-0.6461 lnx+3.4534R20.97550.13-0.060.09讨论我们用反义核酸技术(antisense technique)在mRNA水平上特异性阻断293细胞中hREV3 基因表达，建立了持续和诱导表达反义hREV3 RNA的人胚肾细胞系，发现hREV3基因表达被阻断的细胞系，不论其阻断是持续的还是暂时的其生长与母

23、本293细胞和仅转染了相应载体DNA的细胞系并无明显差异。但对烷化剂MNNG细胞毒作用的敏感性有影响，hREV3表达被反义阻断的细胞系的半数抑制浓度较母本293细胞和相应对照细胞系为低，即对MNNG的敏感性升高。最近在美国癌症研究协会(AACR)第90届年会上Gatza研究小组报道用紫外线(UV)照射反义阻断hREV3基因的人成纤维细胞，其突变率比母本成纤维细胞突变率低。这些结果提示hREV3基因是非细胞增殖所必需，而可能参与细胞易误的跨损伤修复10，造成细胞遗传不稳定和突变的发生。本研究室曾用MNNG在猴肾vero细胞中于未受攻击的碱基部位诱导出突变非定标性突变11，并证实这种非定标性突变的

24、发生依存于处理细胞的基因表达改变；用mRNA差异显示技术分离 部分MNNG处理引起的vero细胞中表达改变的基因片段12，并通过反义核酸阻断技术分离到2个可影响非定标性突变发生的表达序列标识(expression sequence tag, EST)13，14；还证明MNNG处理的vero细胞有DNA复制保真度的降低15，伴有pol的表达明显升高16。本文所建立的细胞系和初步观察结果，将有助于进一步阐明hREV3基因功能以及揭示hREV3基因及其产物真核细胞聚合酶pol与细胞遗传不稳定和非定标性突变发生的关系。?基金项目国家自然科学基金重点项目(No.39830210)徐方（浙江大学医学院病理

25、生理教研室， 浙江 杭州 310031）余应年（浙江大学医学院病理生理教研室， 浙江 杭州 310031）宋韬（浙江大学医学院病理生理教研室， 浙江 杭州 310031）参考文献1Nelson JR, Lawrence CW, Hinkle DC. Deoxcytidyl transferase activity of yeast Revl proteinJ. Nature, 1996,382(6593):729731.2Nelson JR, Lawrence CW, Hinkle DC. Thymine-thymine dimer bypass by yeast DNA polymerase

26、 J. Science, 1996,272(5268):16461649.3Wood RD, Shivji Mk. Which DNA polymerases are used for DNA-repair in eukaryotes?J. Carcinogenesis, 1997,18(4):605610.4Xiao W, Lawchler T, Chow BL, et al. Identification, chromosome mapping and tissue-specific expression of hREV3 encoding a putative human DNA pol

27、ymerase J. Carcinogenesis, 1998,19(5):945949.5胡文蔚，余应年，陈星若，等.构建能与pZ189系列穿梭质粒配套适用的真核细胞表达载体J.中国药理学与毒理学杂志，2000，14(2)：印刷中.6徐方，余应年，胡文蔚.表达反义hREV3基因片段的真核细胞表达质粒的构建J.中国病理生理杂志，1999，15(8)：703706.7萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主编.分子克隆实验指南M.第2版.北京：科学出版社，1996.792793.8司徒镇强，吴军正，主编.细胞培养M.世界书出版社公司，1996.169175.9钱瑛，余应年，陈星若，等.Molecular events after antisense inhibition of hMSH2 in a HeLa cell lineJ. Mutat Res, 1998, 418:6171.10Gatza E, McGrego