W4502副溶血性弧菌检验-国标解读-4-微教材

1、农产品/食品微生物检验课程-微教材微课名称副溶血性弧菌检验-国标解读关键词副溶血性弧菌；检验；国标解读微课类型讲授型微课形式PPT动画式教学设计模式讲授法教学目标了解副溶血性弧菌检验标准版本与范围掌握副溶血性弧菌检验标准检测流程教学内容知识点技能点副溶血性弧菌检验标准版本副溶血性弧菌检验标准范围副溶血性弧菌检验标准流程副溶血性弧菌检验标准的选择副溶血性弧菌检验知识讲解1、副溶血性弧菌检验标准版本副溶血性弧菌的微生物学检验主要依据GB 4789.7-2013食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验进行检验操作以及按照GB 29921-2013 食品安全国家标准 食品中致病菌限量进行评

2、价。2、副溶血性弧菌检验标准版本与范围现行GB 4789.7-2013食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验标准版本与 GB/T 4789.7-2008食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验相比，主要变化如下：1） 修改了标准的中文名称；2） 修改了范围；3） 修改了设备和材料；4） 修改了培养基和试剂；5） 修改了样品制备过程；6） 修改了检验程序。GB 4789.7-2013食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验规定了食品中副溶血性弧菌的检验方法，该适用于食品中副溶血性弧菌的检验3、副溶血性弧菌检验标准流程副溶血性弧菌检验有定性检验和定量检验，均可分成检验准备、

3、检验操作、结果与报告三个部分。其中两者操作鉴定操作部分相同，均包括增菌、分离、纯培养、初步鉴定、确定鉴定5个步骤。1） 增菌-样品制备以无菌操作取样品 25 g（ mL），加入 3%氯化钠碱性蛋白胨水 225 mL，均质，制成 1:10 的样品匀液。注意：液态样品，不需均质，振荡混匀即可；鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃；贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。2） 增菌-培养副溶血菌的检验由定性检验和定量检验两种，定性检验，直接将制备完成的的 1:10 样品匀液于 36 ±1 培养 8 h18h。定量检验，则需要以制备的样品为母液以3%

4、氯化钠碱性蛋白胨水稀释继续制备10倍系列稀释样品匀液；根据检样污染情况，选择 3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种 3 支含有 9 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种 1 mL，36 培养箱内，培养 8 h18 h。3%氯化钠碱性蛋白胨水为选择性增菌液，其高浓度盐含量可抑制除嗜盐微生物外的其他微生物生长。3） 分离操作用接种环在距离增菌液液面以下1 cm 内沾取一环增菌液，分别划线接种TCBS琼脂平板或弧菌显色培养基平板上。本片将分别演示这两种平板的分离现象。接种完成后，置于36 的恒温恒湿培养箱中培养 18 h24 h，待观察。副溶血型弧菌在TCBS琼脂平板上培养一般不超过24

5、h，随培养时间的延长，一些非目标菌（如霍乱）代谢产生的酸会不断挥发，同时代谢蛋白胨产生一定的碱性物质，两者综合导致菌落由黄色逐渐向蓝绿色转变，从而引起误判现象。所以应尽快（不超过1h）挑取菌落或作标记；本实验中各分离平板上的菌落特征如下:TCBS琼脂平板上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2 mm3 mm；弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定，本实验使用法国科玛嘉弧菌显色培养基，现象为紫红色。4） 纯培养用接种环挑取TCBS琼脂平板或弧菌显色培养平板上3个或以上可疑菌落划线接种于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板。挑取可疑菌落时可以选择其中一种平板上的

6、菌落，也可以两种都挑取。置于36 的恒温恒湿培养箱中培养 18 h24 h，待后续鉴定实验。5） 初步鉴定副溶血性弧菌的初步鉴定包括氧化酶试验、革兰氏染色试验、三糖铁（TSI）试验、动力试验以及嗜盐性试验。a） 氧化酶试验：用接种环（或一次性接种环）挑取纯培养单菌落于氧化酶安瓿瓶中，在1 min内观察现象，不变色者为阴性，呈现紫色为阳性；b） 革兰氏染色试验：取洁净载玻片，于其上滴加一滴生理盐水，用接种环将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛； c） 三糖铁（TSI）试验：用接种环挑取纯培养的单菌落，转种3%氯化钠三

7、糖铁琼脂斜面，先在斜面划线，再于底层穿刺，置于36 的恒温恒湿培养箱中培养24 h后观察结果。本片三糖铁（TSI）试验结果为：底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深。三糖铁培养基含有葡萄糖、蔗糖和乳糖等三种可发酵的碳源，这些碳源被菌体利用产酸，可使酚红指示剂变色。某些菌能还原Na2S2O3产生H2S，与硫酸亚铁铵反应生成黑色的FeS，而使培养基变黑。d） 动力试验：用接种针挑取纯培养单菌落，穿刺半固体动力培养基，置于36 的恒温恒湿培养箱中培养24 h后观察结果。动力试验结果为：沿动力培养基中穿刺线扩散生长，有动力；e） 嗜盐性试验：用接种环挑取纯培养的单菌落，分别接种 0%、6%、8

8、%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，置于36 的培养箱中培养24 h后观察液体混浊情况。嗜盐性试验结果为：待检菌在无氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在6%氯化钠和 8%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。根据以上初步鉴定结果可初步判断为可疑副溶血性弧菌属，需进一步做生化鉴定。6） 确定鉴定副溶血性弧菌的确定鉴定包括：3%氯化钠的甘露醇试验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、 MR-VP 培养基以及ONPG 试验试验4个试验。a） 3%氯化钠的甘露醇试验，较高的NaCl浓度可以抑制非嗜盐菌的生长。各种细菌有不同的酶系统，分解糖类的能力各不相同，有的能分解某种糖类产酸产气，有的分解后仅产酸不产生气

9、体。溴甲酚紫在碱性环境中呈紫色，如细菌分解糖产酸，使培养基变为酸性，呈黄色；b） 3%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验，其原理为:较高的NaCl浓度可以抑制非嗜菌的生长。脱羧作用是细菌凭借其特异性脱羧酶作用于氨基酸的羧基，安生一个胺或两个胺和二氧化碳的过程。脱羧作用的结果使培养基pH偏碱性。另外氨基酸的分解是在厌氧条件下进行的；c） MR-VP试验，副溶血性弧菌MR：阳性，VP：阴性。d） ONPG 试验，即-半乳糖苷酶试验，有的细菌可以产生-半乳糖苷酶，能分解邻硝基苯-D-半乳吡喃糖苷（ONPG），而生成黄色邻-硝基酚。实际检测工作中，由于副溶血性弧菌与其他弧菌生化性状相似，且易存在个别变体，可根据初步鉴定结果，从3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行确定鉴定。7） 结果与报告综合以上初步生化与确定生化鉴定结果，副溶血性弧菌定性检验报告25 g（mL）样品中检出或未检出副溶血性弧菌。填写原始记录单和报告；副溶血性弧菌定量检验则根据初步鉴定与确定鉴定，确定疑似阳性管中的阳性管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每g（mL）副溶血性弧菌的MPN值。注意：检验结果报告后，被检样品