α2纤溶酶抑制物和PAP检测方法的建立

1、    2纤溶酶抑制物和PAP检测方法的建立        2抗纤溶酶(2PI）和2抗纤溶酶-纤溶酶复合物(PAP)的改变与血栓性疾病1、DIC、恶性肿瘤等许多疾病相关联，这两个指标的检测对于了解血液系统的纤溶改变有重要意义。我们建立了这两个指标的检测方法，并对它们的特异性、敏感性等进行了探讨。 材料和方法1辣根过氧化物酶(HRP)为Sigma公司产品，纯化的2PI蛋白、兔抗人纤溶酶原多抗为法国Stago公司产品，PAP复合物标准品为日本Aoki教授惠赠。2单克隆抗体(单抗)

2、的制备按常规方法。3鉴定单抗抗原结合位点采用Western blot技术。4单抗对抗原活性的影响单抗与抗原于37共温育30分钟，4过夜，离心取上清液发色底物法检测抗原2PI抑制纤溶酶的活性。5双抗体夹心法检测2PI的方法建立将抗2PI单抗CH-2用包被液(pH 9.6,0.05mmol/L碳酸盐缓冲液)稀释至5g/ml包板，4孵育过夜后用封闭液(含体积分数为3的BSA的PBS)封闭；用稀释液(含10g/L的BSA及体积分数为0.1%的Tween-20的PBS)将待测血浆稀释200倍后加入已包被抗体的酶标板，0.1ml/孔，用将2PI标准品对倍稀释后加入酶标板在492nm处的吸光度(A492)作

3、标准曲线；根据标准曲线来判断待测样本2PI的含量。6双抗体夹心法检测PAP复合物方法的建立将抗Plg多克隆抗体作为固相抗体，10g/ml包板，用HRP标记的CH-7作为液相抗体，其余同2PI检测。7方法学评价各取5份已知2PI和PAP浓度的血浆标本于同一批内测定10次，计算批内变异系数；在不同检测日测定10次，计算批间误差；再取2份已知2PI和PAP浓度的血浆标本，加入一定量的2PI和PAP纯品，测定2PI和PAP的含量，计算回收率；将2PI和PAP标准品对倍稀释后作线性相关分析。8病例选择正常对照组58名，男女各半，年龄2055岁，平均年龄34岁；患者组为肝脏疾病90例；急性非淋巴细胞白血病

4、(ANLL)70例；缺血性脑血管病15例。结果1单抗特性CH-2为IgG 2a型，其腹水效价达5×10-6; CH-7为IgG 1型，其腹水效价为1×10-7; 纯化后单抗在SDS-PAGE上呈现单一条带;杂交瘤细胞株的染色体数为98条左右。2单抗CH-2、CH-7特性的鉴定Western blot 显示，用单抗CH-2杂交可显示正常人血浆泳道中的一条相对分子质量为67×103的条带，为2PI；在含PAP而无2PI的血浆中未出现任何条带。而单抗CH-7杂交在正常血浆中亦显示相对分子质量为67×103附近的一条带，但在含PAP的血浆中则显示出相对分子质量为

5、150×103附近的一条带，此为PAP复合物，而相对分子质量为67×103的条带消失。我们用纯化的2PI及PAP复合物亦得到同样的结果。3单抗对抗原活性的影响单抗CH-2共孵育的抗原2 PI活性下降，而且随着抗体量的增加，其活性下降幅度增大，呈现出剂量依赖关系；而与单抗CH-7共孵育的抗原活性仅轻微改变(1)。     1不同浓度的单抗对2PI抑制纤溶酶活性的影响4抗Plg多抗特性的鉴定琼脂双扩散结果显示，抗Plg多抗可以和PAP复合物形成肉眼可见的沉淀线，说明抗Plg多抗可以和PAP复合物结合。52PI及PAP复合物检测方法的建立2

6、PI的双抗体夹心ELISA法批内误差为4.3%，批间误差为7.5%，回收率为98.0%，线性相关系数为0.9992，线性检测范围为580ng/ml。PAP复合物的双抗体夹心ELISA法批内误差为4.6%，批间误差为4.0%，回收率为92.4%，相关系数为0.9972，线性检测范围为350ng/ml。62PI及PAP复合物检测的临床应用见表1。讨 论我们运用常规免疫方法制备了2PI单抗CH-2、CH-7，单抗CH-2只可以与野生型游离2PI(相对分子质量为67×103)结合，而不能与PAP(相对分子质量为150×103)结合；而CH-7既可以与游离2PI结合，又可以与PAP结

7、合。表12PI 、PAP复合物在正常人及各类疾病中的改变组别例数2PI(mg/L)PAP(mg/L)正常成人5866.9±15.40.59±0.13ANLL组初诊期3052.1±17.11.78±1.08化疗后2562.5±15.21.24±1.05缓解期1570.2±19.70.66±0.21肝脏疾病组9025.1±29.40.74±0.29急性肝炎3034.1±24.90.71±0.09慢性肝炎2023.5±10.50.75±0.25肝硬化2520.3

8、±18.00.76±0.14重症肝炎1517.4±24.90.75±0.19缺血性脑病1523.4±9.91.09±0.45     注：与正常成人组比较，P<0.01， * P<0.05；化疗后与化疗前比较，#P<0.05 国内现有检测2PI抗原的方法有火箭电泳法、免疫扩散法、ELISA法等，它们均建立在多克隆抗体的基础上，所以检测出的结果不仅包括游离的2PI还包括PAP。在DIC、溶栓治疗等患者中，血浆PAP水平显著上升，它干扰了检测结果的准确性，不能准确判断患者的真实游离

9、2PI的水平。我们用CH-2作为固相抗体，用不与PAP结合的CH-7作为液相抗体建立的ELISA法可检测游离2PI，不受PAP的影响。这两个指标可以用于了解这些患者的纤溶异常状态，阐明纤溶改变与临床出血症状和疾病病情变化的关系，尤其PAP在评价存在肝功能受损患者的纤溶状态时更为有用2。基金项目:本课题受胡应洲基金部分资助作者单位：储海燕王鸿利王学锋王振义200025上海第二医科大学附属瑞金医院、上海血液学研究所参考文献1Kario K, Matsuo T, Kodana K, et al. Clinical revelevance of determination of plasma AT and 2-antiplasmin activities in patients with DIC application of the molecular markers for the analysis of pathophysiology of DIC. Rinsloo Byori, 1994, 42:45.2Vukovic