α1(Ⅰ)型前胶原基因反义核酸对增生瘢痕动物模型的抑制作用

1、    1()型前胶原基因反义核酸对增生瘢痕动物模型的抑制作用        【摘要】目的研究1()型前胶原基因反义寡聚核苷酸对人烧伤所致增生性瘢痕裸鼠模型的作用，探讨增生性瘢痕的基因治疗。方法以人烧伤增生性瘢痕移植于裸鼠建立动物模型，分别合成寡聚核苷酸1(ODN1)和寡聚核苷酸2(ODN2)，作用于动物模型，观察不同寡聚核苷酸的抑制作用。结果位于5端翻译区域的21bp的反义寡聚核苷酸1和位于第1个外显子与第1个内含子之间的22bp的反义寡聚核苷酸2能有效抑制增生性瘢痕的生长

2、，对照的RMPI组抑制作用不明显，空白对照组无变化。结论作用于5端翻译区域的反义寡聚核苷酸和作用于第1个外显子与第1个内含子之间的反义寡聚核苷酸能有效抑制型胶原蛋白的合成，从而抑制瘢痕增生。【关键词】型胶原基因反义寡聚核苷酸瘢痕 Inhibiting effect of antisense oligodeoxynucleotide of 1() precollagen gene on hypertrophic scar in an animal modelQI ShaohaiLI TianzengSHAN Yuexin，et al.（Department of Burn Surgery, Th

3、e First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Science, Guangzhou 510080， China）【Abstract】ObjectiveTo study the effect of antisense oligodeoxynucleotide (ODN) of 1() precollagen gene on hypertrophic scar in an animal model. MethodHypertrophic scar was explanted in athymic mice. The e

4、ffect of antisense oligodeoxynucleotide 1 and 2 on the animal model and the inhibition of ODN1 and ODN2 were observed. ResultIt was showed that antisense oligo (ODN1, 21bp) located 5'end from the translation start region and antisense oligo (ODN2, 22bp) between the first exon and the first intro

5、n could effectively inhibit scar hypertrophy. However the control groups showed no inhibition. ConclusionAntisense oligodeoxynucleotide could effectively inhibit scar hypertrophy by inhibiting the synthesis of type collagen protein.【Key words】Type collagen gene; Antisense; Oligodeoxynucleotide; Scar

6、增生性瘢痕主要组织学特点是胶原纤维增生，排列混乱，、型胶原合成和降解不平衡以及、型前胶原mRNA抑制调控失调1，2，型胶原基因突变或基因表达异常，均可导致型胶原蛋白异常沉积，从而影响正常生理功能3，4。抑制胶原合成的潜在环节包括基因的转录、mRNA翻译和翻译后的修饰等5，6，现已清楚胶原蛋白生物合成的生理调控多发生于翻译前水平。研究型胶原基因及其表达调控，有利于寻找有特效的基因治疗途径。反义寡聚核苷酸能以序列特异方式抑制基因表达，在治疗癌症、微生物感染、自身免疫病等方面取得可喜成绩。我们研究了1()型前胶原基因反义寡聚核苷酸对人烧伤所致增生性瘢痕，裸鼠模型的作用，以探讨增生性瘢痕的基因治疗。1

7、材料与方法1.1材料1.1.1试剂RPMI 1640为GIBCO公司产品，Tris-HCl、EDTA，青霉素、链霉素均为国产。1.1.2动物及饲养裸鼠，为单纯T淋巴细胞缺陷(BALB/C-nunu品系)，选6周龄裸鼠，雌雄不拘，由中山医科大学实验动物中心提供并饲养。1.2方法1.2.1烧伤增生性瘢痕动物模型的制备7：将手术切下的烧伤增生性瘢痕切成8 mm×5 mm×3 mm大小，立即放置于RPMI 1640双抗(青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml)组织培养液中，2 h后，将瘢痕组织块移植于6周龄裸鼠背部肩胛内侧皮下，共26只，4周后瘢痕生长并保持原有特性(经光、

8、电镜证实)。1.2.21()型胶原基因反义寡聚核苷酸的合成：根据1()型胶原基因序列，合成5端翻译区域的21bp的寡聚核苷酸1和位于第1个外显子与第1个内含子之间的22 bp的寡聚核苷酸2，均行硫代磷酸化，反义寡聚核苷酸由加拿大真达科技有限公司(Genda Technology Corp Canada)合成、纯化和修饰。1.2.3反义寡聚核苷酸的剂量和瘢痕治疗：以0.01MTris-HCl含10 mM EDTA pH7.4溶液，溶解反义寡聚核苷酸，用RPMI 1640稀释。分成4组，分别为ODN1和ODN2治疗组、RPMI组和空白对照组，每组7只，每只裸鼠瘢痕内注射寡聚核苷酸50 g/100

9、l，其中每组有1只为100 g/100 l，RPMI 1 640为100 l，连用7 d后，测量瘢痕体积大小(长×宽×高)，局部组织反应和裸鼠存活率，并取出瘢痕作形态学检查。1.2.4光、电镜检查：治疗组、对照组瘢痕作HE染色、VG染色供光镜观察；瘢痕组织作透射电镜观察。1.2.5TGF1免疫组化检查4 m厚度切片，每份样本制备HE染色玻片检测瘢痕成熟程度，免疫组化染色(LSAB)，工作浓度为Anti-TGF 1 150，0.6%DAB显色，Mayer苏木素复染。1.2.6毒性检测：注射局部组织反应、裸鼠存活率。1.2.7瘢痕治疗效果的评估：完全反应(CR)指瘢痕退化，部分

10、反应(PR)指瘢痕体积减小或无增生，以及无反应(NR)。2结果2.1瘢痕体积大小的变化ODN1、ODN2、RPMI及空白组治疗前(后)的瘢痕体积分别为65(42)、63(37)、62.2(55)、56(52) mm3(表1)，ODN2、ODN2治疗前(后)的瘢痕体积差异有显著性意义，P0.05，RPMI及空白组治疗前(后)的瘢痕体积差异无显著性意义，P0.05。2.2光、电镜检查治疗前瘢痕组织结构致密，胶原纤维粗大，排列紊乱，成纤维细胞形态正常，核分裂相较多，粗面内质网、线粒体丰富；ODN1、ODN2治疗后瘢痕组织结构疏松，胶原密度低，胶原纤维变小，排列相对整齐，成纤维细胞粗面内质网少，有脱颗

11、粒现象，线粒体少，部分出现空泡化和断裂，胞核有畸形。整张片的活细胞都有大量吞噬颗粒，估计可能是吸收的ODN。对照组无明显变化(15)。表1治疗后瘢痕体积的变化(mm3)Tab 1Changes of scar volume after treatments (mm3)组别ODN1ODN2RPMI空白治疗前65±1263±1860±1556±10治疗后42±18*37±13*55.0±5.5#52±12#与治疗前比较：*P0.05，#P0.05 2.3TGF 1在瘢痕组织中的分布治疗前和RPMI组及空白对照组的瘢痕组

12、织的TGF 1在成纤维细胞、纤维细胞、慢性炎症细胞和内皮细胞呈弥漫强阳性反应。治疗组的成纤维细胞少，纤维细胞增多，血管数目减少，TGF 1呈阳性反应或灶性阳性反应。治疗组和对照组的细胞外基质的TGF 1呈弥漫强阳性或阳性分布(6，7)。2.4局部组织反应注射反义寡聚核苷酸的局部皮肤无红肿、溃烂、皮疹、硬结。2.5裸鼠存活率连续注射反义寡聚核苷酸7 d后，所有裸鼠都存活，未出现消瘦、行动迟缓等情况。2.6治疗效果的评估(表2)1反义核酸作用前的瘢痕组织，成纤维细胞丰富，胶原纤维致密，排列混乱，血管多(HE×100)Fig 1There are plenty of fibroblasts

13、, collagen fi bre and vasculars in scar tissue before treatment with antisense oligodeoxynucle otide2反义核酸作用后的瘢痕组织，成纤维细胞减少，胶原疏松(HE×100)Fig 2Few of fibroblasts and collagen f ibre can be seen after treatment with antisense oligodeoxynucleotide3对照组的瘢痕成纤维细胞粗面内质网、线粒体丰富，形态结构正常，周围胶原纤维较多(TEM×5200)

14、Fig 3Lots of rough endoplasmic reticula (rER), mitochondrid (M) an d collagen in the cytoplasm of fibroblast in control group4反义核酸组的瘢痕成纤维细胞粗面内质网较少、有脱颗粒现象，线粒体少，胞核畸形，胞内有吞噬颗粒(可能是吸收的ODN)，细胞周围胶原纤维较少(TEM×5200)Fig 4 Few of rough endoplasmic reticula (rER), mitochondrid (M) and co llagen can be seen in

15、 the cytoplasm of fibroblast, the ribosome of rER is degran ulated, the nucleous is abnormal, there are a lot of granule (maybe the antisens e oligodeoxynucleotide) in the cytoplasm (TEM×5200)5反义核酸作用后的瘢痕成纤维细胞内有大量吞噬颗粒(可能是吸收的ODN，TEM×5200)Fig 5 Lots of granule can be seen in the cytoplasm of

16、fibroblast (maybe the antisense oligodeoxynucleotide) after treatment (TEM×5200)6ODN治疗后，瘢痕组织TGF-1呈弱阳性反应(免疫组化染色×100)Fig 6After treatment with ODN, the scars tissue showed weak staining for TGF-17治疗前瘢痕组织TGF-1呈强阳性反应(免疫组化染色×100)Fig 7The scars tissue showed str ikingly strong staining for

17、TGF-1 before treatment3讨论反义核酸技术是根据碱基互补原理，使用与目标靶的遗传物质(mRNA、或DNA)特定互补的短核酸片段封闭基因表达的技术方法。作用的机理是导入某个有害基因的互补寡核苷酸，通过序列特异性和非序列特异性反义作用，与基因组相应mRNA或双链DNA结合，形成部分双链分子或三链核酸，从而定向封闭靶基因，阻断相应基因的表达，以达到治疗目的。反义核酸通过硫代磷酸化修饰后，增强其核酸酶抗性而增加其在体内的稳定性和有效浓度。Laptev8用人工合成的反义寡核苷酸抑制人1()前胶原基因的表达，与对照组相比，抑制率最高达67%，提示增生性瘢痕的基因治疗的可能性。我们通过对

18、增生性瘢痕动物模型局部注射后电镜观察的结果提示，反义核酸的绝大部分可能被成纤维细胞、巨噬细胞和肥大细胞所吞噬，说明导入靶细胞效果较理想。作用后第8 d，见ODN1、ODN2组的瘢痕明显缩小，成纤维细胞粗面内质网减少，胞核畸形的成纤维细胞多见，胶原纤维减少，巨噬细胞和肥大细胞无明显变化。治疗后瘢痕组织TGF 1的免疫定位分布强度减弱，提示ODN1、ODN2通过抑制胶原基因的表达而抑制瘢痕增生。表2反义核酸对增生性瘢痕动物模型的治疗Tab 2Antisense treatment of hypertrophic scar in athymic nude mice组别瘢痕数量ODN剂量(g/100

19、l)治疗反应注释CRPRNRODN16501瘢痕退化，体积减少41体积平均减少35.4%，1例无变化11001体积减少，退化不明显ODN2650151例瘢痕退化，瘢痕体积平均减少41.3%11001瘢痕退化，体积减少RPMI6100(l)15瘢痕体积平均减少8.6%空白对照6-15瘢痕体积平均减少7.1%反义核酸有很多优点：可大量合成、使用方便；毒性小，动物存活率高；可直接注射。但也存在不少问题：不同序列的片段结果差异大；特异片段在实际工作中不易找到，需要大量筛选，费用高，工作量也大；反义核酸作用所需时间，量效关系，作用远期效果如何?有待进一步研究。同时，对照组均有1例出现部分反应，可能是动物

20、个体差异和缺乏原瘢痕体内环境所致，因此寻找更理想的增生性瘢痕动物模型是基因治疗的迫切要求。有关工作正在进行。(本文17见插页第19页) 本课题受广东省重点科技攻关项目资助作者单位：祁少海（510080中山医科大学附属第一医院烧伤科）利天增（510080中山医科大学附属第一医院烧伤科）黎志明（510080中山医科大学附属第一医院烧伤科）谢举临（510080中山医科大学附属第一医院烧伤科）单越新（中山医科大学生物化学教研室）罗超权（中山医科大学生物化学教研室）吴义方（中山医科大学电镜室）参考文献1，Vitto J, Porejda AT, Abergel RP, et al. Alterd ste

21、ady-state ratio of type / procollagen mRNAs correlates with selectively increased type procollagen biosythesis in cultured keloid fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:5935-5939.2，Zhang LQ， Laato M, Muona P, et al. Normal and hypertrophic scars: quantification and localization of messagers RNA

22、s for type , and collagens. Br J Dermatol,1994,130:453-459.3，Brenner DA, Westwick J, Breindl M, et al. Type collagen gene regulation and the molecular pathogenesis of cirrhosis. Am J Physiol,1993,264(4 pt 1):G589-G595.4，Varga J, Jimenez SA. Modulation of collagen gene expression and its relation to fibrosis in systemic sclerosis and other fibrotic disord