HPLC法测定不同产地鬼臼类药材中鬼臼毒素的含量

1、在我国 , 鬼臼类药材包括小檗科鬼臼亚科 Dysosma versi-pellis (Hance. M.Cheng Podophylloideae 桃儿七属 Sinopodop-hyllum 、 山荷叶属 Diphylleia 、 八角莲属 Dysosma 等 3个属 , 各属 代表药用植物分别有桃儿七 S. hexandrum (S. emodi (Wall. ex Royle Ying 、 南方山荷叶 D. sinensis H. L. Li 以及八角莲 D. versipellis (Hance M.Cheng 。 鬼臼类药材主要以干燥根茎入 药 1。 主要成分鬼臼毒素为芳基四氢萘类木质

2、素 , 具有抗肿 瘤 、 抗病毒等活性 2, 以及祛风除湿 、 活血止痛 、 镇咳平喘等功 能 3。 鬼臼类药材因其多种植物来源而导致异名繁多 、 品种混 用现象比较严重 , 屡有因用法用量问题而引发中毒事件 4。 鬼 臼毒素为其主要毒性成分 , 不同产地药材中鬼臼毒素含量差 异较大 , 鬼臼类药材饮片中毒剂量从几克到几十克不等 5。 为 了比较不同产地鬼臼类药材的毒性大小 , 本试验用高效液相 色谱 (HPLC 法测定不同产地鬼臼类药材中鬼臼毒素的含量 , 以为临床安全合理用药提供依据 。1仪器与试药Ultimate 3000型 HPLC 仪 , 包括四元梯度泵 、 自动进样器 、紫外检测器

3、 (美国戴安公司 ; Chromeleon 软件数据处理系统 。 甲醇为色谱纯 , 水为纯化水 , 氯仿 、 磷酸二氢钾为分析 纯 ; 鬼 臼 毒 素 对 照 品 (中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 , 批 号 : 111645-200301 ; 鬼臼类药材分别采于湖北 、 重庆 、 云南等 地 , 由郧阳医学院药学系生药教研室陈吉炎教授提供并鉴定 为真品 。2方法与结果2. 1供试品溶液的制备精密称取各样品粉末 (过 2号筛 1g , 置于 250mL 锥形瓶 中 , 加氯仿 50mL , 回流提取 1h , 过滤 , 滤液挥干 , 残渣用甲醇 溶解 , 定容于 50mL 容量瓶中

4、 , 备用 。2. 2对照品溶液的制备精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥 12h 的鬼臼毒 素对照品 10mg , 置于 10mL 容量瓶中 , 用甲醇溶解并稀释至 刻度 , 摇匀 , 备用 。2. 3色谱条件色谱柱 :Diamonsil C 18(250mm×4. 6mm , 5m , 前加预柱 (10mm×4. 6mm ; 检测波长 :290nm ; 柱温 :30 ; 流动相 :甲 醇 -0. 1mol ·L -1磷酸二氢钾 (45 55 ; 流速 :1. 0mL ·min -1。 色谱 图见图 1。HPLC 法测定不同产地鬼臼类药材中鬼臼毒素的含

5、量 赵祖兴 1, 2*, 杨光义 2#, 陈吉炎 2, 叶 方 2, 郝新才 2(1. 湖北中医学院药学院 , 武汉市 430061; 2. 郧阳医学院附属 太和医院 , 十堰市 442000中图分类号 R 284. 1; R 927. 2文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2010 19-1784-02摘 要 目的 :建立以高效液相色谱法测定不同产地鬼臼类药材中鬼臼毒素含量的方法 。 方法 :色谱柱为 Diamonsil C 18(250mm×4. 6mm , 5m , 流动相为甲醇 -0. 1mol ·L -1磷酸二氢钾 (45 55 , 检测波长为 290n

6、m , 柱温为 30 , 流速为 1. 0mL ·min -1。 结果 :不 同产地鬼臼类药材所含鬼臼毒素的量差异较大 , 其中以产自湖北竹溪的山荷叶含量最高 , 产自湖北房县的六角莲含量最低 (二者 含量相差近 4倍 。 结论 :不同产地 、 不同品种的鬼臼类药材中鬼臼毒素含量不同 , 故各地的中毒剂量不同 。关键词 鬼臼毒素 ; 高效液相色谱法 ; 鬼臼亚科 ; 含量测定Content Determination of Podophyllotoxin in Podophylloideae from Different Habitats by HPLCZHAO Zu-xing (S

7、chool of Pharmacy , Hubei College of Traditional Chinese Medicine , Wuhai 430061, China ZHAO Zu-xing , YANG Guang-yi , CHEN Ji-yan , YE Fang , HAO Xin-cai (Taihe Hospital of Yunyang Medical College , Shiyan 442000, China ABSTRACT OBJECTIVE :To establish HPLC method for the content determination of p

8、odophyllotoxin in podophylloideae col-lected from different habitats. METHODS :Diamonsil C 18(250mm×4. 6mm , 5m was used with methanol-0. 1mol ·L -1KH 2PO 4 (45 55 as mobile phase at a flow rate of 1. 0mL ·min -1. The detection wavelength was set at 290nm and column temperature was 30

9、 . RESULTS :The contents of podophyllotoxin in podophylloideae form different habitats were different from one another , among which the content of podophyllotoxin in Diphylleia sinensis from Zhuxi in Hubei province was the highest while that in Dys-osma pleiantha from Fangxian in Hubei province was

10、 the lowest (difference between two kinds of plants of nearly 4times . CON-CLUSION :The contents of podophyllotoxin are different because of the different species and regions. The dose of podophyllotoxin which induce toxicosis is different.KEY WORDS Podophyllotoxin ; HPLC ; Podophylloideae ; Content

11、 determination*硕士研究生 。 研究方向 :中药鉴定与新制剂开发 。 E-mail :sa-#通讯作者 :讲师 , 主管药师 , 博士 。 研究方向 :中药资源开发和新Pharmacy V ol. 21No. 中国药房 201021卷第 19期 年第 19Pharmacy 2010V ol. 212. 4方法学考察2. 4. 1线性关系考察 :精密量取鬼臼毒素对照品溶液 1. 0、 2. 0、3. 0、 4. 0、 5. 0mL , 分别置于 10mL 容量瓶中 , 加甲醇稀释至刻 度 , 摇匀 , 按 “ 2. 3” 项下色谱条件测定峰面积 。 以峰面积积分值 (Y 为纵坐标

12、, 鬼臼毒素含量 (X 为横坐标 , 制备标准曲线 , 得 回归方程为 Y =85. 2859X +1. 6881(r =0. 9998 。 结果表明 , 鬼 臼毒素的进样量在 0. 1561. 3mg ·mL -1的范围内与峰面积积 分值呈良好的线性关系 。 2. 4. 2精密度试验 :精密吸取鬼臼毒素对照品溶液 10L , 重复进样 5次 , 测定 。 结果 , RSD =0. 0026%, 表明仪器精密度良好 。 2. 4. 3稳定性试验 :取供试品溶液 , 分别于配制后 0、 2、 5、 8、 10h 进样 。 结果 , RSD =0. 0114%(n =5 , 表明供试品溶

13、液在 10h 内检测对结果无影响 , 稳定性良好 。2. 4. 4重复性试验 :按 “ 2. 5” 项下方法操作 , 对同一样品重复测定 6次 , 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10L 。 结 果 , RSD =0. 42%, 表明方法重复性良好 。 2. 4. 5加样回收率试验 :精密称取已测含量的样品 , 分别精密加入低 、 中 、 高浓度的对照品 , 按 “ 2. 1” 项下方法制备供试品溶液 , 按上述色谱条件测定 。 结果 , 其平均回收率为 100. 06%, RSD =1. 99%, 说明该测定方法可行 。 加样回收率试验结果见表 1。表 1加样回收率试验结果 (n =9

14、 Tab 1Results of recovery test (n =9取样量 /g0. 48090. 48090. 48090. 58030. 58030. 58030. 59860. 59860. 5986样品含量 /mg14. 614. 614. 617. 717. 717. 718. 218. 218. 2加入量/mg12. 612. 612. 617. 117. 117. 120. 120. 120. 1测得量 /mg27. 127. 627. 135. 334. 334. 738. 638. 138. 1回收率 /%99. 21103. 1799. 21102. 9297. 089

15、9. 42101. 4999. 0099. 00/%100. 06RSD /%1. 992. 5样品含量测定精密量取对照品溶液及供试品溶液各 10L 进样 , 以外标一点法计算鬼臼毒素含量 。 药材样品来源 、 编号及鬼臼毒素 含量测定结果见表 2。B图 1高效液相色谱图A. 鬼臼毒素对照品 ; B. 供试品Fig 1HPLC chromatogramsA. podophyllotoxin control ; B. test sample表 2药材样品来源 、 编号及鬼臼毒素含量测定结果Tab 2Source and number of podophylloideae and content

16、determination of it编号样品来源 购自湖北十堰 , 产地重庆 购自湖北郧县白桑 , 产地湖北竹溪 购自湖北十堰 , 产地云南 购自湖北十堰 , 产地重庆 购自湖北房县 , 产地湖北房县采自湖北房县桥上乡三座淹村大峡沟 购自湖北十堰 , 产地重庆 清大药业代购 , 产地湖北竹溪 清大药业代购 , 产地湖北竹溪 购自湖北十堰 , 产地重庆鉴定结果八角莲 D. versipellis M. Cheng 南方山荷叶 D. sinensis H. L. Li. 南方山荷叶 D. sinensis H. L. Li. 八角莲 D. versipellis M. Cheng 八角莲 D.

17、versipellis M. Cheng 六角莲 D. pleiantha Woods. 南方山荷叶 D. sinensis H. L. Li. 南方山荷叶 D. sinensis H. L. Li. 南方山荷叶 D. sinensis H. L. Li. 南方山荷叶 D. sinensis H. L. Li.含量 /g·g -10. 14180. 53710. 39820. 16030. 15360. 13960. 33800. 31440. 29440. 4709保留时间 /min33. 44333. 39633. 04033. 57433. 29633. 12033. 35333. 11632. 79033. 2963讨论10批样品的测定结果表明 , 鬼臼毒素含量最多的依次是产地湖北竹溪的南方山荷叶 、 产地重庆的南方山荷叶 、 产地云 南的南方山荷叶 , 含量最少的是产地湖北房县的六角莲 。不同产地 、 不同品种的鬼臼类药材所含鬼臼毒素差异较 大 , 故用生药材入药时 , 各种药材的中毒剂量也有差异 。参考文献1马绍宾 , 胡志浩 . 小檗科鬼臼亚科的地理分布与系统发育 J.云南植物研究 , 1997, 19(1 :48. 2尚明英 , 徐珞珊 , 李萍 , 等 . 鬼臼类中药及其木脂素类成分的药效学研究 J.中草药