脉冲场凝胶电泳及随机扩增多态性DNA对淋球菌的基因分型

1、    脉冲场凝胶电泳及随机扩增多态性DNA对淋球菌的基因分型        【摘要】目的评价脉冲场凝胶电泳限制性内切酶 分析(PFGE-REA)及随机扩增多态性DNA(RAPD)分析对淋球菌分离株进行基因分型的能力。 HTH 方法36株淋球菌分离株基因组DNA以Spe酶切及脉冲场凝胶电泳。并以随机引物OPA-03对36株菌进行RAPD分析。结果PFGE-REA在36株菌中产生1 219个DNA片段(5600kb)，区分出20种PFGE型。以OPA-03扩增淋球菌DNA，获得

2、15个不同 的DNA片段(2801900bp)。每株菌有39个片段。36株菌呈现18种RAPD型。研究表明，PFGE -REA与RAPD可区分属相同营养型及抗生素谱的菌株，二种方法分型结果总的趋向一致。不同地区的分离株甚至同一地区的某些分离株存在相当大的DNA多态性。具相同或十分相似基因型的菌株为某一特定地区所特有。认为PFGE-REA及RAPD是鉴别淋球菌临床分离株有用而 敏感的分子技术，有助于了解菌株来源、菌株间的克隆相关性及抗生素耐药性的传播。与PF GE-REA相比，RAPD分析相对快速、简便和经济。【关键词】淋球菌基因分型PFGERAPD Molecular Typing of Ne

3、isseria Gonorrhoeae by Pul sed-field Gel E lectrophoresis and Random Amplified Polymorphic DNA AnalysisSu Xiaoh ong and Ye Shunzhang. Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Scien ecs, Peking Union Medical College, Nanjing 210042 【Abstract】ObjectiveTo evaluate the ability of restriction

4、 endonuclease analysis by pulsed field gel electrophoresis (PFGE-REA) and random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis for molecular typing of Neiss eria gon orrhoeae isolates. MethodsGenomic DNA from 36 Neisseria gonorr hoeae isolates were digested with SpeI and analysed by contour -clampe d ho

5、mogeneous electric fields electrophoresis. The 36 isolates were also charact erised by RAPD analysis with arbitrary primer OPA-03. Results 1219 DNA fragments from 5 to 600kb were obtained among the 36 isolates a fter P FGE-REA. The 36 isolates were discriminated into 20 PFGE patterns. Amplificatio n

6、 of Neisseria gonorrhoeae DNA with primer OPA-03 produced 15 d ifferent DNA fra gments (2801900bp), and 39 fragments per strain could be seen. The 36 is olat es showed 18 different RAPD patterns. Strains sharing common auxotypes and anti biotic spectrum could be differentiated by PFGE-REA and RAPD a

7、nalysis. General agreement was f ound between these two techniques. Isolates from different geographic areas and even some isolates in the same area showed considerable amount of DNA polymorph ism. In addition, some isolates shared common or very similar pattern s we re unique to a given geographic

8、area. ConclusionIt is concluded that both PFGE-REA and RAPD analysis are useful, sensitive molecular tech niques for differentiation of clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae . They s hould be helpful in the investigation of strain origin, clonal relation am ong st rains and spread of antibiotic

9、 resistance. Compared with PFGE-REA, RAPD analysi s is faster, relatively simple and more economical. 【Key words】Neisseria GonorrhoeaeGenotypingPF GERAPD 最近，脉冲场凝胶电泳(PFGE)及随机扩增多态性DNA(RAPD)作为分子分型方法 已用于多种病原微生物的分子流行病学研究1，2。本研究中，我们在抗生素敏感性测定及营养分型基础上，应用PFGE及RAPD对36株淋球菌临床分离株进行了基因分型，以期能更仔细地了解某些特定菌株间的克隆或流行病学相

10、关性，提高对淋球菌诊断及分类的认识。现将结果报道如下。材料和方法(一)菌株：本研究包括以下4组菌株：南京市3对患者-性伴分离的6株菌 。每对菌株的抗生素谱及营养型相同。福州市分离的9株需脯氨酸(Pro-)型多重耐药菌株。重庆市分离的10株原型菌株，其中6株为多重耐药菌株，其余4株抗生素敏感性不同。 11株产青霉素酶淋球菌(PPNG)，分别由南京(7株)、福州(1株)及重庆(3株)分离。(二)主要试剂：蛋白酶K(德国，Merk)，低熔点琼脂糖(美国，Sigma)，脉冲电泳用琼脂糖( 美国，Sigma)，稀切点内切酶Spe(美国，Sigma)，DNA多聚体(瑞典，Pharmacia)，Taq DN

11、A聚合酶(华美生物工程公司)，4种dNTP(德国，BM)。(三)主要仪器：CHEF-DR型脉冲电泳仪(美国，Bio-Rad)，1109基因扩增仪(北京新技术应用研究所)。(四)方法：1.PFGE限制性内切酶分析(PFGE-REA)：基因组DNA的制备：主要参照Poh3 的方法，简述如下。淋球菌细胞悬液与等体积的1.5%低熔点琼脂糖(40)混匀，迅速加到样品模具的孔洞中，4冷凝20分钟。根据108个细菌大约产生0.7g DNA HT6 4，每100l凝胶块约含6g DNA。将胶块置EC裂解液(6mmol/L T ris*HCl，100mmol/L EDTA，1mol/L NaCl，0.2%脱氧胆

12、酸钠，0.5% SLS，溶 菌酶1mg/ml ，RNA 1g/ml)，37孵育68小时。再置ESP液(0.5mol/L EDTA，pH9.0，1% SLS，蛋白 酶K 500g/ml)，52孵育40小时。限制性内切酶酶切：采用150l反应体积：灭菌三蒸水1 00l，10×内切酶反应缓冲液15l，10mg/ml牛血清白蛋白1.5l，DNA胶块30l(约2 g)，Spe30U，37孵育14小时。PFGE：酶切后的DNA胶块置于1%琼脂糖凝胶的载样孔中 ，以DNA多聚体为分子量标准。设置电泳参数如下：电压200V，脉冲时间535秒。在10 0.5×TBE电泳缓冲液中电泳20小时。

13、胶块经溴化乙锭染色及双蒸水脱色，于透射式紫外检 测仪下观察结果并拍照。2.RAPD分析：模板DNA的制备：将培养18小时的淋球菌菌苔(一白金耳)置一个Eppendorf管 中 ，加入300l灭菌三蒸水，水浴煮沸10分钟，冷却后，14 000r/min 4离心5分钟。取上清液作110稀释用作模板DNA。引物：根据文献5选择10个碱基的寡聚核苷酸随机引物 OPA-03：AGTCAGCCAC。PCR扩增：采用25l反应体积。其中模板DNA 2l，4种dNTP各 20 0mol/L，MgCl22.5mmol/L，引物200pmol/L，Taq DNA聚合酶1U。94预变性5分钟后 ，按94 1分钟，3

14、6 1分钟和72 2分钟，在基因扩增仪上进行45个循环，最后一个循环 72 10分钟。每株菌同时扩增二管。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶(含0.5g/ml溴化乙锭) 中电泳，以PCR Marker为分子量标准，于透射式紫外检测仪下观察结果。结果(一)PFGE-REA结果：36株淋球菌基因组DNA经Spe酶切及PFGE，产生121 9个片段(5600kb)。根据片段的大小和数目不同，以一个片段差异分型，36株菌中区分出2 0种PFGE型。不同地区分离株的PFGE谱具明显多态性。性伴组3对配对菌株的PFGE谱两两相同。福州9株Pro-型多重耐药菌株中有6种不同的PFGE型(1)。重庆10株原型菌株

15、中区分出5种PFGE型，其中6株多重耐药菌的谱完全一致。不同地区分离的11株PPNG 中存在6种PFGE型。南京7株PPNG中有4株PFGE谱相同，另3株谱亦十分相似。    1：DNA多聚体210：2-1，2-7 ，2-6，2-2，2-3，2-5，2-4，2-9，2-81 HTSS 福州地区9株需脯氨酸型淋球菌的PFGE限制性谱 (二)RAPD分析结果：应用OPA-03引物在36株淋球菌中扩增出15个分子量不 同(2801900bp)的特异片段。每株菌的扩增指纹分别由39个片段构成，共产生18种RAPD 型。全部菌株中扩增出1200bp片段。除1株外，

16、35株亦有420bp片段。每株菌扩 增2管， RAPD指纹基本一致。性伴组每对菌株的RAPD指纹相同。福州9株Pro-型多重耐药菌株中有6种RAPD型(2)。分型结果与PFGE不完全一致，如PFGE谱相同的菌株RAPD指纹不同，或情况相反。重庆10株原型菌呈现4种RAPD型。6株多重耐药菌的RAPD型相同，与PFGE结果 一致。11株PPNG    19：2-1，2 -2，2-3，2-4，2-5，2-6，2-8，2-7，2-910：PCR Marker2福州地区9株需脯氨酸型淋球菌 的RAPD指纹中有5种RAPD型。南京7株PPNG的扩增指纹基本相同，6

17、20bp片段为南京PPNG 所特有。讨论 本研究结果表明，PFGE-REA及RAPD可区分属相同营养型及抗生素谱的菌株 ，二种方法分型结果总的趋向一致。不同地区甚至同一地区的分离株中存在相当大的DNA多态性，而具相同或十分相似基因型的菌株常为某一特定地区所特有。我们发现重庆分离的6 株原型多重耐药菌的PFGE谱及RAPD指纹完全相同，提示它们可能来自同一克隆。南京不同时期分离的7株PPNG中有4株PFGE谱相同并与其余3株相似，这7株菌的RAPD指纹亦基本相同，提示它们可能来自一共同菌株或最近发生了变异，亦提示其流行病学相关的可能性。此外，患者-性伴组每对菌株的PFGE型及RAPD型相同，表明

18、患者与性伴相互接触传染。福州9株Pro-型多重耐药菌的遗传异质性则提示多个克隆来源。 PFGE-REA识别整个基因组的限制性位点多态性，提供细菌染色体结构的信息。对多种细菌的研究结果表明1，6，其分辨力高，结果可靠，重复性好。然而，需特殊仪器、试剂昂贵及方法费时是应用PFGE-REA的限制因素。RAPD是在传统PCR基础上建立起来的检测基因组DNA多态性的新方法7。其优点是扩增指纹具多态性，方法简便、快速及广泛实用性。研究表明，RAPD的分辨力低于或相等于PFGE -REA，适当的引物及理想的PCR条件对获得高分辨力是必要的。合用二个引物或分别采用二个或多个引物进行RAPD可提高分型能力8，9

19、。与PFGE-REA相比，RAPD易受实验条件人为差异的影响，对反应条件进行优化及严格的控制可获得较好的实验室内重复性，以同批号试剂一次扩增(同等扩增条件)对所有分离株进行分型，可避免批间差异。参考文献1 Gordillo ME, Singh KV, Murray BE. Comparison of ribotypi ng and pulsed-field gel electrophoresis for subspecies differentiation of strai ns of Enterococcus feacalis. J Clin Microbiol, 1993,311570-1

20、 574.2 Bingen E, Barc MC, Brahimi N, et al. Randomly amplified polymorphic DNA analysi s provides rapid differentiation of Methicillin-resistant coagulase-negative s taphylococcus bacteremia isolates in pediatric hospital. J Clin Microbiol, 1995, 331657-1657.3 Poh CL, Lau QC. Subtyping of Neisseria

21、gonorrhoeae auxo type-se rovar groups by pulsed-field gel electrophoresis. J Med Microbiol, 1993,38366 -370.4 Smith CL, Condemine G. New approaches for physical mapping of small gen omes. J Bacteriol, 1990,1721167-1172.5 Camarena JJ, Nogueira JM, Dasi MA, et al. DNA amplification fingerprint ing for su btyping Neisseria gonor