新藤黄酸的研究

1、新藤黄酸固体分散体的制备【摘要】：新藤黄酸是一种弱酸性的难溶性物质，毒性和不良反应大，而且静脉给药时有强烈的血管刺激性，此外，新藤黄酸在体内的半衰期短，由于这些特性限制了其临床应用。而固体分散体制备技术是将难溶性高度分散的在固体载体材料中，形成固体分散体（solid dispersion）的新技术。关键词：固体分散体；溶出度；载体材料。一药物的基本情况：新藤黄酸( neo-gambogic acid,NGA)又称为藤黄号, 是从藤黄科植物藤黄中提取分离出来的一种抗肿瘤有效成分。藤黄( Gamboge) 系藤黄科植物藤黄( Garcinia hanburyiHook.f)所分泌出的干燥树脂, 呈

2、红黄色或橙红色, 圆柱形或不规则的块状物, 质脆易碎, 主要产于柬埔寨、泰国、越南, 是我国传统进口南药。研究证实, 藤黄中的藤黄酸( Gambogic acid)、新藤黄酸( Neogambogic acid) 为藤黄抗肿瘤作用的有效成分, 具有抗瘤谱广, 毒性较低的特点。1 研究表明，藤黄酸、新藤黄酸均具有较强的抗肿瘤作用，其抗瘤谱广，毒性较低，能选择性地作用于肿瘤细胞，而对正常动物造血系统和免疫功能影响较小，对肺癌、胰腺癌、胃癌等具有较好的疗效3 6，是极具开发前景的天然抗肿瘤药物。在藤黄中, 新藤黄酸的含量可达到8.01% 37.8% 7 , 新藤黄酸的熔点mp.76.478.0。因此

3、如何优化其提取分离工艺具有实际意义。二.药物当前制剂的类型1.新藤黄酸纳米粒 新藤黄酸水溶性较差, 易降解,且毒性和不良反应较大, 将其制备成新藤黄酸纳米粒可以提高它的生物利用度, 减少对正常组织的毒性和不良反应，新藤黄酸纳米粒由安徽中医学院胡容峰等研制8。2.新藤黄酸包合物冻干粉 新藤黄酸是一种难溶的弱酸性药物，经L-精氨酸助溶后制成的静脉注射剂对给药部位有一定的刺激性，为了降低其用药刺激性，选用注射用羟丙基-环糊精（HP-CD）作为包合材料对其进行包合，再采用真空冷冻干燥法制备包合物冻干粉针。冻干粉具有较好的稳定性和溶解性，可供溶血性和血管刺激性实验研究。该制剂由安徽中医学院胡海霞等研制9

4、。3. 新藤黄酸固体脂质纳米粒 新藤黄酸固体脂质纳米粒以生理相容的高熔点脂质为骨架材料制备，将药物包裹或内嵌于类脂核中，制成粒径约为501000nm的固体胶粒给药系统，副作用小，室温及体温下呈固态粒子10。结合临床需求和目前制剂的发展情况，安徽中医学院陈卫东等将新藤黄酸药制备成固体脂质纳米粒，控制粒径大小，期望减小新藤黄酸的血管刺激性，提高体内生物利用度，更好地发挥其药理作用11。4. 新藤黄酸亲水凝胶骨架缓释片 骨架缓释片是目前制药工业应用和开发最活跃的剂型之一,它具有制备工艺简单, 安全性好, 组方容易等特点。新藤黄酸具有显著的抗肿瘤活性, 对小鼠腹水型肝癌、艾氏腹水癌、肺癌等有显著的抑杀

5、作用, 作为一种天然抗肿瘤药物, 具有广阔的开发前景11。安徽中医学院赵煤矿等采用羟丙甲基纤维素( HPMC) 为主要缓释材料, 研制12h给药1次的新藤黄酸亲水凝胶骨架片, 并优化处方, 得到最佳制剂工艺12。 三. 新藤黄酸固体分散体的制备 新藤黄酸是一种弱酸性的难溶性物质，毒性和不良反应大，而且静脉给药时有强烈的血管刺激性，此外，新藤黄酸在体内的半衰期短，由于这些特性限制了其临床应用。而固体分散体制备技术是将难溶性高度分散的在固体载体材料中，形成固体分散体（solid dispersion）的新技术。其特点是提高难溶性药物的融出速率和溶解度，以提高药物的吸收和生物利用度。固体分散体可看作

6、是中间体，用以制备药物的速释和缓释制剂，也可制备肠溶剂13。藤黄醇提物中含量最多的是藤黄酸，其次为新藤黄酸。将藤黄树脂溶于一定体积的吡啶，使得藤黄树脂中含量最多的酸性成分藤黄酸与吡啶成盐而析出，含量少的成分留在母液中。这样，可使母液中新藤黄酸的含量增加，达到富集的目的。1.新藤黄酸的制备1.1 藤黄酸吡啶盐的制备取藤黄醇提物(40 g)，按质量:体积(MV)比11.5加入吡啶60 mL于70水浴上加热溶解,趁热抽滤,滤液转移至200mL烧杯中,用少许吡啶润洗抽滤瓶,合并洗液和滤液，按体积比(VV)10013加入10mL40温水充分搅拌，放置冰箱冷却过夜。析出橘红色沉淀，抽滤，滤饼依次由70%吡

7、啶溶液，水各洗3次，80烘干得到黄色藤黄酸吡啶盐粗品12.5g进一步精制，酸化得藤黄酸,滤液待用14。1.2 新藤黄酸的制备将滤液用1%盐酸水溶液调pH= 4,乙酸乙酯萃取。合并有机层，水洗至近中性，用无水硫酸钠干燥。过滤，减压回收溶剂，得桔红色粉末。取5g置100mL圆底烧瓶中，用丙酮溶解,加100200目硅胶适量拌样。选用长约为50 cm内,径为4 cm的层析柱，用100200目硅胶装柱，柱长高度为20cm,在用真空泵抽负压1h，加入制备好的拌样硅胶，再加1cm100200目硅胶，真空泵抽负压0.5 h先以乙酸乙酯石油醚二乙胺=1100.05为流动相进行洗脱，再依次用乙酸乙酯石油醚二乙胺=

8、 110.05，乙酸乙酯二乙胺= 10.05、甲醇乙酸乙酯二乙胺= 1200.05、甲醇乙酸乙酯二乙胺= 1100.05 等不同组成的流动相进行梯度洗脱，TLC检测，收集不同的组分。TLC显示，洗脱液为甲醇乙酸乙酯二乙胺= 1100.05的组分即为目标物新藤黄酸。将收集液减压浓缩至干，残留物加乙酸乙酯溶解，1%HCl 水溶液洗涤至有机层不含二乙胺，再水洗至近中性，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，得亮黄色粉末新藤黄酸1.24g，收率为24.8%( 以母液处理物计) 15 。2. 载体材料 固体分散体的融出速度在很大程度上取决于所用载体材料的特性。载体材料应具有下列条件：无毒、无致

9、癌性、不与药物发生化学变化、不影响主药的化学稳定性、不影响药物的疗效与含量检测、能使药物得到最佳分散状态或缓释效果、价廉易得。常用的载体材料可分为水溶性、难溶性和肠溶性三大类16。因为综合考虑的新藤黄酸的化学特性和物理性质，新藤黄酸固体分散体的载体材料采用肠溶性载体材料。常用的载体材料有纤维素类和聚丙烯酸树脂类：2.1 纤维素类 常用的有纤维醋法酯、邻苯二甲酸羟丙甲纤维素以及羧甲乙纤维素，因为均能溶解于肠溶液中，用来制备胃中不稳定的药物在肠道释放和吸收、生物利用度高的新藤黄酸的固体分散体。由于它们的化学结构不同，黏度有差异，释放速率也不相同。CAP和PEG联用制成固体分散体，可控制释放速率，有

10、较好的临床开发应用前景。2.2 聚丙烯酸树脂类 常用Eudragit L100和Eudragit S100。3. 固体分散体的类型 共沉淀物（也称共蒸发物）是由药物与载体材料以恰当的比例混合，形成共沉淀无定形物，有时也称玻璃态共熔体，因其有如玻璃的质脆、无确定的熔点17。4.分散体的制备4.1 仪器：UV-1601型紫外可见分光光度计( 日本岛津) ，ZRS-8G 智能溶出试验仪，ZK-82A真空干燥箱，HWS24型温水浴锅，DPL-0.5 流化床包衣机( 重庆精工制药机械有限公司) ，DTA1700 差热分析仪( 美国Perkin-Elmer公司)4.2 材料：新藤黄酸原料药(过80目筛)，

11、PEG6000、PEG4000、PVPK30 ，聚乙烯吡咯烷酮K30，泊洛沙姆188(F68，BASF)，十二烷基硫酸钠(SLS)，空白小丸( 100目，自制)，其他试剂均为分析纯。4.3 实验方法 NGA固体分散体的制备:溶剂一熔融法称取处方量的NGA与载体，将载体置80水浴中加热，将NGA用适量无水乙醇溶解，待载体完全熔融时加入NGA溶液，同时剧烈搅拌，待混合物至黏稠状态时，在冰浴中剧烈搅拌至完全固化，在冰箱中冷冻30min，然后置真空干燥箱中40干燥过夜，取出，粉碎，过80目筛备用18。5 溶出速率的测定5.1 检测波长的确定 精密称取NGA12.5mg，置25mL量瓶中，用少量无水乙醇

12、溶解，加025SLS溶液稀释至刻度，然后精密量取适量，用025SLS溶液配制成浓度为50mgL溶液；分别配制浓度为300 mgL的PEG6000、PEG4000、F68和PVPK30的0.25SLS溶液，按照中国药典2010年二部附录A紫外一可见分光光度法在200400nm波长范围内进行扫描。结果NGA在结果在220nm和360nm均有最大吸收波峰, 而辅料在此无吸收,为了排除溶剂的干扰,选择360nm为新藤黄酸的检测波长。5.2 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液(0.2mg/ml)0.5, 1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 ml分别置于7个10ml棕色容量瓶中, 加甲醇溶解并

13、稀释至刻度,混匀,0.45m微孔滤膜滤过依次进样20l, 按上述色谱条件,以峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标进行线性回归,得回归方程为:A=52216c-12098(n=7),r=0.9999。5.3 回收率试验 精密称取NGF对照品12.0,15.0，0.18.0 mg各3份，置25mL量瓶中，按处方比例加人相应的载体，用用少量无水乙醇溶解,加0.25SLS溶液稀释至刻度，分别制成高、中、低3个浓度的溶液各3份，滤过，取续滤液1mL置10mL量瓶中，加0.25SLS溶液稀释至刻度，摇匀，在360nm处测定吸光度，计算回收率19。表一 不同载体分散体3种浓度的回收率实验结果载体 高浓度 中浓度

14、 低浓度PEG6000PEG4000F68PVPK305.4 溶出度实验 将相当于NGA30 mg的固体分散体装入胶囊，按照中国药典2010年版二部转篮法，以0.25SLS溶液900mL为溶出介质，转速为100r·min-1，温度(37±0.5)oC，分别在15、30、45、60min取样10mL,滤过,同时补加10mL同温同体积溶出介质，取续滤液于360 nm波长处测定吸光度。测定结果代入标准曲线计算浓度，并换算成累计溶出百分率。6.正交试验设计 取新藤黄酸，按所选因素及水平( 表2 )，采用L9( 33 ) 正交表设计试验( 表3) 进行新藤黄酸固体分散体的制备，得19

15、号产物，备用20。 表二 新藤黄酸固体分散体制备工艺因素水平水平 A 载体用量 B干燥时间 C 干燥温度 / oC /g·g-1 /h-1 14150251.56036270表三 新藤黄酸固体分散体制备工艺正交设计及其结果No A B C 新藤黄酸2h累计融出率/%1 1 1 1 2 1 2 23 1 3 34 2 2 25 2 3 16 2 1 27 3 3 28 3 1 39 3 2 1K1K2K3R五 讨论 新藤黄酸制成固体分散体后其溶出速率提高，可能是因为新藤黄酸分散到载体材料的分子中，在冷却析出时，载体材料阻滞药物分子聚集进而形成较小的晶粒，甚至转变成无定型，使得药物溶解度

16、增加。此外，高分子载体材料本身具有很好的亲水性，易润湿，也可加速药物溶出。参看文献：1 刘卫海,赖小平,周兴挺. 新藤黄酸的研究进展,J,时针国医国药，2010 21（9）：234749.2 刘卫海,肖国丽,赖小平等。新藤黄酸诱导HepG2 细胞凋亡与Bax 及Bcl-2 的关系，J，中国药理学通报，2012 28( 3) : 43940.3 朱国旗,王效山,李庆林等. 新藤黄酸体外抑制肺腺癌A549 细胞增殖的作用，J,安徽中医学院学报，2011 30（1）：5356.4 陈葆仁.藤黄抗癌成分的研究,江西医学学报，1980（2）1.5 Qinglin LI, HuiCheng,Guoqi Z

17、HU. Gambogenic Acid Inhibits Proliferation of A549 Cells through Apoptosis-Inducing and Cell Cycle Arresting,J, Biol. Pharm.Bull.33(3) 415420 (2010).6 周兰贞，晏烽根，李庆林. 新藤黄酸诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的作用机制研究,J, 基础研究·Basic Research,2011 7(31):580584.7 胡钟，何黎琴，王效山. 新藤黄酸制备工艺优化,J,广州化工，2011 39（24）3637.8 胡容峰,朱金燕. 高效液

18、相色谱法测定新藤黄酸纳米粒中新藤黄酸的含量和包封率,J,安徽中医学院学报，2009 29（1）4951.9 胡海霞，王效山，彭代银. 新藤黄酸包合物冻干粉针制备及工艺优化,J, Chinese Traditional and Herbal Drugs,2012 43(1) 6569.10 Annette zur Muhlen, Cora Schwarz, Wolfgang Mehnert. Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled drug delivery Drug release and release mechanism ,J, European Journal of Pharmaceutic