青蒿叶片愈伤组织的诱导和植株再生

1、    青蒿叶片愈伤组织的诱导和植株再生作者：伍晓丽，刘飞， 李隆云， 钟国跃【摘要】 目的探讨以青蒿幼嫩叶片再生植株的 方法 。方法以青蒿幼嫩叶片为外植体，接种于附加不同激素组合的MS培养基，进行愈伤组织诱导和植株再生。结果以6BA0.1 mg/L+2，4-D0.3 mg/L诱导愈伤组织，在含6BA0.1 mg/L+IAA0.3 mg/L的培养基上分化，用含IAA0.1 mg/L+ NAA0.3 mg/L的培养基生根。结论 用以上方法可以在较短周期内从幼嫩叶片得到再生青蒿植株。 【关键词】 青蒿； 植物激素； 愈伤； 再生Abstract：Object

2、iveTo explore the way of regeneration of plants from leaves of Artemisia annua L.MethodsTo plant the leaves of Artemisia annua L. on mediums plus different plant hormones. Results The  suitable callus-inducing medium was MS+ 6BA10 mg/L+2,4D0.3 mg/L. The suitable regenerating medium was MS+

3、6BA0.1 mg/L+IAA0.3 mg/L. The suitable rootinducing medium was MS+IAA0.1 mg/L+ NAA0.3 mg/L.ConclusionYoung plants can regenerate from leaves in a short span by the method above.Key words：Artemisia annua L； Plant hormones； Callus； Regeneration青蒿(Artemisia annua) L，又名黄花蒿，是菊科一年生药用草本植物。提取物青蒿素对脑疟疾和氯喹疟疾具有高

4、效低毒的抗疟性能，WHO已经认定复方青蒿素成药为 目前 最安全有效的抗疟药。现在世界上已经有51个国家和地区在WHO推荐下将其列为抗疟指定用药。这使得全球对青蒿素原料的需求猛涨，从2004年开始已出现了从原料到成品药各个环节的严重供货短缺1。目前该药物虽然能人工合成，但成本很高，未能实际生产2， 工业 上主要从青蒿植株中提取。目前青蒿因长期处于野生状态，未能选育出高含量的品种，青蒿素含量极低，而且其含量还受土壤营养、地理环境、气候等多种因素 影响 34，大大增加了该药的生产成本。为此，高青蒿素含量的青蒿品种选育工作重要性日益凸显，而组织培养正是 现代 育种技术的一个重要组成部分，本实验初步探讨

5、了青蒿叶片的愈伤组织诱导和植株再生技术，为进一步的育种 研究 打下基础。1 材料与方法1.1 材料酉阳本地生产用种，由重庆市中药研究院生药栽培室提供。1.2 方法1.2.1 培养基配制基本培养基为培养基，附加蔗糖30 g/L,琼脂15 g/L，pH调节至5.8。附加激素如下：（12）IAA0.1 mg/L+ NAA1.0mg/L1.2.2 外植体处理剪取20 cm高青蒿苗上的幼嫩叶片，剪成0.5 cm2的小块，无菌水中浸泡3 h，75%乙醇漂洗1 min，于5%次氯酸钠溶液中浸泡3 min，无菌水漂洗4次，接种。培养条件为25，2000 Lx光照、14 h/d。2 结果与 分析 观察发现，不同

6、激素组合对青蒿的愈伤诱导、植株再生和生根均有显著影响。2.1 愈伤组织诱导接种后的叶片呈灰绿色水浸状，貌似死亡，培养基（2）和（5）上的叶片，在接种后第5天叶片边缘开始出现鲜绿色的颗粒，直径约0.51.0 mm左右，呈致密状态，10 d后，愈伤生长达到高峰，在多处叶片边缘出现。培养基（5）上的愈伤在接种后15 d开始分化出绿色丛生芽点，但只停留在这一阶段，不能进一步分化成苗。培养基（2）上的愈伤一直保持致密颗粒状。培养基（1）（3）（4）（6）上的叶片没有愈伤出现，只是叶片边缘有少部分返绿，返绿部分取下接种于分化培养基上渐渐褐化死亡。不同培养基愈伤组织诱导率见表1。表1 愈伤组织诱导率（略）2

7、.2 芽的分化将培养基（2）和（5）上的愈伤分别转入分化培养基（7）（8）（9），5 d后，（8）和（9）上的愈伤均分化出苗，10 d后达高峰时期。（8）上的苗生长较正常，（9）上的苗丛生密度过大，苗型细弱，生长缓慢，（7）上的愈伤只能保持在丛生芽点状态，30 d后即渐渐褐化死亡。培养基（5）中产生的愈伤组织分化率明显大于培养基（2）中产生的愈伤组织。3种分化培养基中幼苗分化率结果见表2。表2 培养基（2）和（5）上的愈伤组织幼苗分化率（略）2.3 根的分化小苗约12 cm高时转入生根培养基，3 d后即可在小苗基部见到白色新根，不同培养基根分化率如表3。表3 幼苗根分化率（略）可见，随着NAA

8、浓度增高，根分化率反而降低，以培养基（10）较合适。从叶片接种到小苗出瓶移栽，整个周期约1个月左右。此外，在实验期间还用培养了约2个月的青蒿无菌苗叶片接种培养基（2）和（5），叶片在培养基上皱缩，边缘褐化，最后死亡，始终无愈伤出现。2.4 试管苗移栽试管苗揭去瓶盖，在室内炼苗3 d，4 h/d；3 d后，置于室外弱光荫蔽处炼苗2 d，4 h/d；2 d后，移栽已高压灭菌的珍珠岩，浇透定根水，每天叶面喷水保湿12次，约15 d后，见苗基部长出乳白色新根，心叶开始生长，即表明成活，带土移栽大田。移栽成活率93%以上。3 小结本实验的 研究 表明，以青蒿幼嫩叶片为外植体，MS培养基为基本培养基，附加

9、6BA 1.0 mg/L+2,4D 0.3 mg/L诱导愈伤组织，附加6BA 0.1 mg/L+IAA 0.3 mg/L的培养基上分化，附加IAA 0.1 mg/L+ NAA 0.3 mg/L的培养基生根，可以在较短周期内从幼嫩叶片得到再生青蒿植株。该结果可 应用 于青蒿的生物技术育种，尤其是倍性育种上，具体思路如下：用秋水仙素溶液浸泡刚发芽的幼苗，幼苗在小花钵中生长，得到嵌和体植株，取生长初期的数片真叶（该叶片可能是多倍体组织），通过组织培养再生植株，得到纯合的多倍体植株。无菌苗叶片接种诱导培养基，无愈伤出现，初步推测，可能是缺乏消毒过程的刺激，不能产生具有补偿外界伤害作用的愈伤组织，其具体原因有待进一步研究。【 参考  文献 】1 中国 中医药信息杂志通讯员. 世界卫生组织呼吁中国增加青蒿素产量J.中国中医药信息杂志, 2005, 12(8)：110.2许杏样青蒿素及其一类物结构和合成的研究J.有机化学，1982,6：44