矮丛蓝莓叶片的愈伤组织诱导及植株再生

1、西北植物学报,2010,30(3):0615-0620文章编号:100024025(2010)03206152063矮丛蓝莓叶片的愈伤组织诱导及植株再生韩婷婷,孙周平3(沈阳农业大学园艺学院,辽宁省设施园艺重点实验室,沈阳110161)摘要:以矮丛蓝莓Blomidon品种的试管苗叶片为外植体,研究不同培养基、激素、转接时间以及转接方式对愈伤组织诱导及植株再生的影响。结果表明:WPM1/2为适宜的培养基;添加0.5mgL-1CPPU+1.0mgL-1ZT+0.5mgL-1TDZ和0.5mgL-1CPPU+0.5mgL-1ZT+1.0mgL-1TDZ诱导愈伤率较高达100%;ZT、CPPU与生长素

2、IAA、IBA的配比诱导愈伤率效果不佳;添加ZT诱导的愈伤组织适合20d后转接,CPPU诱导的愈伤组织适合50d后转接;转接方式均以固体培养为宜。矮丛蓝莓Blomidon最适宜培养基为WPM1/2+0.5mgL-1CPPU+1.0mgL-1ZT+0.5mgL-1TDZ,其诱导愈伤组织50d后转接平均分化芽数最多达10.26个。关键词:矮丛蓝莓;叶片;组织培养;愈伤组织;植株再生中图分类号:Q813.1+2文献标识码:ACallusoffoliumLeavesHANTing2ting,SUNZhou2ping3(Collegeof,ShenyangAgriculturalUniversity,K

3、eyLaboratoryofProtectedHorticultureofLiaoningProvince,Shen2yang110161,China)Abstract:PlantletleavesinvitroofVacciniumangustifoliumBlomidonwereusedastheexplants,effectsofthedifferentmedia,hormones,switchingtimeandswitchingmethodsoncallusinductionandplantre2generationwerestudied.Theresultsshowedthat:W

4、PM1/2wasasuitableculturemedium;mediawith0.5mgL-1CPPU+1.0mgL-1ZT+0.5mgL-1TDZ和0.5mgL-1CPPU+0.5mgL-1ZT+1.0mgL-1TDZhada100%rateforcallusinductioncallus;ThecombinationofZT,CPPUwiththeauxinIAA,IBAcouldnoteffectivelyinducedcallus;AddtheZTandCPPUinducedcalluswereswitched,theap2propriatetimeforcallusculturew

5、as20dand50d,respectively.Comparedwiththesolutionmedium,thesolidculturemethodwasbetter.TheaboveresultsindicatedthatthemostsuitablemediumwasWPM1/2+0.5mgL-1CPPU+1.0mgL-1ZT+0.5mgL-1TDZforVacciniumangustifoliumBlomidon,whichtheaveragenumberofadventitiousbudsupto10.26whenthecalluswasswitchedafter50d.Keywo

6、rds:Vacciniumangustifolium;leaf;tissueculture;callus;regeneration蓝莓(Blueberry)又名越橘、蓝浆果,属杜鹃科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)。蓝莓果实风味独3收稿日期:2009210213;修改稿收到日期:2010203205特,营养丰富,含有丰富的维生素、矿物质和抗氧化物质,特别是其中所含的花青素、儿茶酸,有防治高基金项目:辽宁省教育厅创新团队项目(2007T159);辽宁省“十一五”重大项目资助(2006215001)()()作者简介:韩婷婷1983-,女汉族,硕士,主要从事植株组织培养研究。E2m

7、ail:hanting.12053通讯作者:孙周平,博士,副研究员,硕士生导师,主要从事植物组织培养和设施园艺栽培生理等研究。E2mail:zhoupingsun 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 616西北植物学报30卷血压、疏通毛细血管和缓解视力疲劳的作用,被誉为“浆果之王”,被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一。因此,近十多年来,世界蓝莓种植面积和产量大幅增加,其中,美国是世界第一大蓝莓生产国,年产量达到世界的50%1,2。1983年中国吉林农业大学率先从

8、国外引进蓝莓品种,并开展了组培快繁育苗与配套栽培技术等研究2。近二十多年来,中国蓝莓产业有了快速发展,面积达到3万余亩,成为目前最具发展潜力的水果之一。国外在蓝莓组织培养方面的研究做的较多,已在多个类群中建立了微型繁殖或不定芽继代繁殖程序。主要有高丛蓝莓(V.corymbosum)327,矮丛蓝莓(V.angustifolium)8210,兔眼蓝莓(V.ashei)11,蔓越橘(V.macrocarpon)idaea)13121.2方法1.2.1培养基筛选选取MS、B5、WPM19、WPM1/2(WPM中各组分都减半)、1/2WPM(WPM中大量元素减半,其它组分不变)5种培养基进行培养。加入

9、蔗糖20gL-1,琼脂8gL-1,ZT(Zeatin)2mgL-1,pH5.2。每个处理20瓶,每瓶接种35个完整叶片。暗培养10d后,再光照培养40d进行观察。1.2.2适宜细胞分裂素及其配比研究在筛选出的培养基上,分别加入2mgL-1CPPU(Forchlor2fenuron)、2mgL-1ZT、2mgL-1TDZ(Thidja2zuron),及其配比0.5mgL-1CPPU+1mgL-1ZT+0.5mgL-1TDZ;0.5mgL-1CPPU+0.5mgL-1ZT+1.0mgL-1TDZ;1.0mgL-1CPPU+0.5mgL-1ZT+0.5L-1TDZ,其,红豆越橘(V.vitis2。蓝

10、莓叶片的离体再生是利用生物工程技术转导外源基因进行品种创新的基础,国外已经开始这方面的研究14217。在中国马怀宇等18率先开展了蓝莓离体叶片再生研究,并建立了蓝莓高丛、半高丛多个品种的高频高效再生体系;1使用改良的1/2MS(伯克利)和(Bluecrop,但对于矮丛蓝莓,理都无法获得令人满意的结果8210。而矮丛蓝莓(美登)品种风味非常独特、Blomidon并具有抵御-40的抗寒能力,适宜中国大兴安岭、小兴安岭和它条件同培养基筛选实验。1.2.3选用,ZT、aceticacid)、IBA(In2)进行配比,其它条件同培养基筛选1.2.4适宜转接时间研究选择质地较好的愈伤组织,分别在其形成20

11、、50d后将所选的愈伤组织切成约5mm2的小块,转接到WPM培养基中培养,ZT0.3mgL-1,每瓶转接愈伤组织3块。其它条件同培养基筛选实验,培养40d后进行观察。1.2.5适宜转接方式研究在形成愈伤组织50d后将质地好的愈伤组织切成约5mm2的小块,一部分转接到固体培养基WPM中,一部分转接到悬浮培养液中,悬浮培养3d后换入新鲜的培养液,再培养3d后用去离子水洗净转接到固体培养基中培养。加入ZT0.3mgL-1,蔗糖20gL-1,固体培养基加入琼脂8gL-1,悬浮培养液不加琼脂,pH为5.2,悬浮培养条件同光照培养。每个处理10瓶,每瓶转接愈伤组织3块。40d后进行观察。1.3分析统计方法

12、数据统计按下列公式:愈伤组织诱导率(%)=(形成愈伤组织的外植体数/接种外植体数)100%愈伤组织褐化率(%)=(愈伤组织褐化数/接种的愈伤组织数)100%平均分化芽数=分化不定芽总数/分化不定芽的愈伤组织数所得数据采用Excel和SPSS软件处理分析。长白山等高寒地区种植,也是目前出口与加工最理想的品种之一18。为此,本试验以矮丛蓝莓Blo2midon品种为试材,系统研究培养基、激素、转接时间及转接方式对叶片愈伤组织形成和植株再生的影响,拟初步建立矮丛蓝莓美登品种叶片再生体系,以期为矮丛蓝莓品种的快速繁殖、种质资源保护、遗传转化与种质创新等提供理论依据和技术支持。1材料和方法1.1材料以矮丛

13、蓝莓(Vacciniumangustifolium)Blo2(美登)品种试管苗的成熟叶片为外植体,近midon轴面向上,远轴面向下接入瓶内培养基中。在沈阳农业大学设施园艺重点实验室组培室内进行培养,光照强度2500lx,光照时间12hd-1,温度(251)。 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 3期韩婷婷,等:矮丛蓝莓叶片的愈伤组织诱导及植株再生6172结果与分析2.1不同培养基对离体叶片愈伤组织诱导的影响2.3不同细胞分裂素和生长素配比对离体叶片愈表1为5种不同培

14、养基对离体叶片愈伤组织诱导的影响。从表1可以看出,B5、MS、WPM培养基不适合蓝莓品种Blomidon叶片再生。而随着WPM培养基所含离子浓度的降低,离体叶片愈伤伤组织诱导的影响由表3可知,ZT、CPPU与IAA配比中,愈伤组织易褐化,IAA浓度的增加降低了愈伤组织诱导率。ZT浓度增加有效减缓了褐化,CPPU对愈伤量影响明显,且随着CPPU浓度的增加愈伤量增加。ZT、CPPU与IBA配比中,多为叶柄处出愈,叶片被托起无愈伤组织形成(图版,3)。ZT与IBA配比组织诱导率逐渐增加,这表明,WPM1/2为适宜培养基,愈伤组织诱导率达到了86.67%,差异显著(P0.05)。表1不同培养基对离体叶

15、片愈伤组织诱导的影响Table1Effectofdifferentmediaonthecallusinductionofleaf培养基种类MediumB5MSWPM1/2WPMWPM1/2中,随着IBA浓度增加愈伤组织颜色由淡黄绿色变为绿色,诱导率有下降趋势。CPPU与IBA配比中,随着IBA浓度增加愈伤组织颜色由淡黄色变为黄色,诱导率无明显变化趋势。IBA对形成的愈伤组织颜色有一定影响。总体上看,随着细胞分裂素浓度的增加,愈伤组织诱导率增加。但在细胞分裂素与生长素配比中愈伤组织量较少,且随着生长素浓细胞分裂素与2.4接种数IncubateNo.1001001006060出愈数CallusNo

16、.0c0c0c14b52a诱导率Inductionrate/%0.00c0.00c0.00c23.33b86.67a,CPPU诱导的愈伤组织20d后转,8.23个(图版,4)。ZT诱导的愈伤组织50d后转接,平均出芽数为8.87个(图版,5)。TDZ诱导的愈伤组织转接后易褐化、且分化形成不定芽的能力弱。0.5mgL-1CPPU+1.0mgL-1ZT+0.5mgL-1TDZ诱导的愈伤组织50d后转接培养、褐化率最低,平均分化芽数最高,达10.26个,显著高于其它处理(P0.05),芽呈绿色,质量较好(图版,6),为分化不定芽的最适愈伤组织。0.5mgL-1CPPU+0.5mgL-1ZT+1.0m

17、gL-1TDZ诱导的愈伤组织在两个时期转接培养后、分化芽数相差不大(图版,7)。1.0mgL-1CPPU+0.5mgL-1ZT+0.5mgL-1TDZ诱导的愈伤组织宜20d后转接,平均分化芽数分别为8.65个(图版,8)。结果表明:CPPU及其注:表中不同小写字母表示差异显著(P0.05)。Note:DifferentnormallettersmeanatPel.Thesameasbelow.2.2织诱导的影响由表2可知,在WPM1/2培养基中各种细胞分裂素及其配比均诱导形成了愈伤组织,其中CPPU(图版,1)和TDZ诱导的愈伤组织量较多,由配比结果可知,CPPU对愈伤量影响较大,且随着CPP

18、U浓度的增加愈伤量也增加。配比0.5mgLCPPU+1.0mgL-1ZT+0.5mgL-1TDZ(图版,2)和0.5mgL-1CPPU+0.5mgL-1ZT+1.0mgL-1TDZ愈伤组织诱导率均为100%,大于单一细胞分裂素诱导率。ZT诱导率低,且愈伤量少,但愈伤质地较好、为浓绿色紧密愈伤。-1表2不同细胞分裂素及其配比对离体叶片愈伤组织诱导的影响Table2Effectofdifferentcytokininsandratioonthecallusinductionofleaf激素种类Hormone/(mgL-1)CPPU2.0ZT2.0TDZ2.0CPPU0.5+ZT1.0+TDZ0.5

19、CPPU0.5+ZT0.5+TDZ1.0CPPU1.0+ZT0.5+TDZ0.5诱导率Inductionrate/%90.00ab83.33b93.33ab100.00a100.00a90.00ab愈伤质地Callustexture淡绿色紧密Lightgreenclose浓绿色紧密Concentratedgreen淡绿色紧密Lightgreenclose淡绿色紧密Lightgreenclose淡绿色紧密Lightgreenclose淡黄绿色紧密Lightyellow2greenclose愈伤量Calluscontent/g0.54a0.11c0.49a0.29b0.26b0.59a 1994-

20、2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 618西北植物学报30卷表3不同细胞分裂素和生长素配比对离体叶片愈伤组织诱导的影响Table3Effectofdifferentratioofcytokininsandauxinsonthecallusinductionofleaf激素种类Hormone/(mgL-1)诱导率Inductionrate/%65.00ef76.67cde55.00f70.00def78.34bcde85.00abcd90.00abcd78.34bcde80.0

21、0bcde86.67abcd86.67abcd76.67cde80.00bcde76.67bcde81.67bcde91.67abc96.67a91.67abc95.00ab95.00ab愈伤质地Callustexture褐色颗粒状Browngranular绿色颗粒状Greengranular全部褐化AllBrowning大多褐化Mostofbrowning淡绿色颗粒状Lightgreengranular淡绿色颗粒状Lightgreengranular淡绿色颗粒状Lightgreengranular绿色颗粒状Greengranular绿色颗粒状Greengranular绿色颗粒状Greengr

22、anular淡褐色颗粒状Lightbrowngranular淡褐色颗粒状Lightbrowngranular淡褐色颗粒状Lightbrowngranular淡褐色颗粒状Lightbrowngranular淡黄绿色颗粒状Lightyellow2greengranular淡黄绿色颗粒状Lightyellow2greengranular淡黄绿色颗粒状Light2green黄色颗粒状黄色颗粒状愈伤量Calluscontent/g0.14b0.16b0.11b0.13b0.09b0.12b0.13b0.14b0.11b0.12b0.22a0.26a0.28a0.26a0.11b0.11b0.14b11b

23、0.15b0.18bZT1.0+IAA2.0ZT2.0+IAA2.0ZT1.0+IAA5.0ZT2.0+IAA5.0ZT1.0+IBA0.5ZT2.0+IBA0.5ZT3.0+IBA0.5ZT1.0+IBA3.0ZT2.0+IBA3.0ZT3.0+IBA3.0CPPU3.0+IAA2.0CPPU3.0+IAA5.0CPPU5.0+IAA2.0CPPU5.0+IAA5.0CPPU1.0+IBA0.5CPPU3.0+IBA0.5CPPU5.0+IBA0.5CPPU1.0+IBA3.0CPPU3.0+IBA3.0CPPU5.0+IBA3.0表4Table4Effectofrateandthenumb

24、erofbudsunderdifferenttreatment20d50dCPPU2.0ZT2.0TDZ2.0CPPU0.5+ZT1.0+TDZ0.5CPPU0.5+ZT0.5+TDZ1.0CPPU1.0+ZT0.5+TDZ0.5褐化率Browningrate/%0.00d100.00a100.00a100.00a76.67b13.33c平均出芽数Averagenumberofbudding8.23a0.00c0.00c0.00c5.29b8.65a褐化率Browningrate/%100.00a50.00c90.00ab10.00d56.67c80.00b平均出芽数Averagenumber

25、ofbudding0.00e8.87b2.00e10.26a5.69c3.88d表5不同转接方式对愈伤组织分化不定芽的影响Table5Effectoftransferingmethodsonadventitiousbudsofcallus转接方式Transferingmethod愈伤变化Calluschange褐化率Browningrate/%73.33a0.00b平均分化芽数Averagenumberofbudding3.00b10.13a悬浮培养+固体培养Suspensionculture+Solidculture固体培养Solidculture形成水渍状透明胚状物Mizusawa2sha

26、pedtransparentembryo形成绿色簇状芽Clusteredgreenbud浓度高的配比诱导的愈伤组织宜在20d后转接,ZT及该激素浓度高的配比诱导的愈伤组织宜50d后转接。2.5不同培养方式对愈伤组织分化不定芽的影响由表5可知,悬浮培养的愈伤组织呈水渍透明状,有玻璃化现象,且形成的芽段粗而矮,叶片卷曲,愈伤组织褐化率达73.33%,平均出芽数低。悬浮培养形成的芽转接到固体培养基后部分不定芽水渍状现象减轻,逐渐正常生长。固体培养基培养形成正常的芽,愈伤组织无褐化现象,每块愈伤组织平均出芽数高达10.13个,分离成单株培养后正常生长(图版,9)。 1994-2010 China Ac

27、ademic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 3期韩婷婷,等:矮丛蓝莓叶片的愈伤组织诱导及植株再生6193讨论本文以矮丛蓝莓Blomidon品种的试管苗叶片为外植体,通过对不同培养基、激素及其配比、转接时间以及转接方式对愈伤组织诱导及植株再生影响进行研究,建立了矮丛蓝莓Blomidon品种植株叶片再生体系,为进一步研究奠定了基础。在基本培养基方面,本研究结果表明,B5、MS、WPM培养基均不适宜矮丛蓝莓Blomidon叶片愈伤组织的诱导及其植株再生,1/2WPM培养基愈伤诱导率为23.33%,WPM1/2愈伤诱

28、导率可达86.67%,说明降低培养基中总离子浓度、减少离子组织量较少,但等量愈伤组织上分化芽数较多,而且单一激素及该激素浓度高的配比都有此现象。TDZ也有增加愈伤量的作用,但由TDZ诱导的愈伤组织转接培养后褐化率高,分化不定芽数少。这与James等20研究结果比较一致,他们对高丛蓝莓离体叶片再生研究发现,ZT在促进不定芽发生的过程中不经历愈伤组织阶段,而TDZ在促进不定芽发生的过程中一般都经历愈伤组织阶段,然后在愈伤组织中发生不定芽。而与马怀宇等18在高丛蓝莓离体叶片再生研究结果不同,他们研究认为,5.0mgL-1ZT和13.0mgL-1CPPU对蓝莓离体叶片再生效果最好,再生率可达85%以上

29、,而加入TDZ只对个别品种的再生有效果,再生率为0%30%。一般研究认为,细胞分裂素和生长素共同控制着多种植物的愈伤组织生长与器官分化,但本实验中CPPU、ZT与IAA、18研,采用固体培养诱导形成的愈伤组织20d后转,而ZT诱导形成的愈伤组织50d后转接较好,转接天数可能与切割时愈伤组织大小及其内部形态有关。采用液体悬浮培养会诱发芽形成,但大多数芽玻璃化严重,虽转接后逐渐缓解,但畸形芽较多、转接后易死亡。因此,有关转接方式还有待进一步研究。渗透势和压力,有利于矮丛蓝莓叶片愈伤组织诱导分化。这与陶建敏等1研究结果比较一致,他们研究认为,改良的1/2MS(1/2MS大量元素,2倍MS铁盐)培养基

30、适合高丛蓝莓的培养。相反的,马怀宇等18对高丛蓝莓离体叶片再生研究却表明,WPM培养基最适合高丛蓝莓叶片再生,1/2WPM略次之。此外,James等20研究认为有些植物特别是木本植物适宜在B5培养基培养,原因是B5有较低的铵。,0.5mgL-10-1ZT5mgL-1TDZ50d后转接到固体培养基中,愈伤组织最佳。其中,CP2PU有增加愈伤量的作用,而使用ZT时产生的愈伤参考文献:1TAOJM(陶建敏),GENGQF(耿其芳),ZHUANGZHM(庄智敏).Constructionofthehigh2efficiencyregenerationsystemofblueberrywithitsle

31、avesJ.ActaBot.Boreal.2Occident.Sin.(西北植物学报),2006,26(3):610-614(inChinese).2WUL(吴林),LIYD(李亚东),ZHANGZHD(张志东),YUQB(于强波).Studiesonthewinterinjuryofhighbush,half2highhigh2bushandlowbushblueberryJ.JournalofFruitScience(果树学报),2004,21(4):341-345(inChinese).3NICKERSONNL.Invitroshootformationinlowbushblueberr

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