诺沃克病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒

1、 诺沃克病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒操作手册（第一版）适用于各种食品类材料、卫生监督、疾病控制等来源的临检样品2006.12深圳易瑞生物技术有限公司试剂盒组成产品目录号规格48次检测诺沃克病毒RT-PCR一步法反应液1080µl / 1管逆转录酶（5U/µl）24µl / 1管Taq酶（5U/µl）20µl / 1管诺沃克病毒G、G型阳性对照100µl / 1管诺沃克病毒阴性对照100µl / 1管操作手册1份注：本试剂盒不包括诺沃克病毒RNA提取试剂，用户可采用通用型病毒RNA提取试剂盒或试剂盒推荐的提取方法。产品介

2、绍² 本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，用于食品中的诺沃克病毒的检测。符合SN/T1635-2005贝类中诺沃克病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法行业标准要求。² 检测灵敏度：可达100拷贝/ml，定量检测线性范围可达10-1010拷贝/ml。² 特异性：本试剂盒根据最新基因序列数据库设计，并通过系统验证，能够检测所有已知G、G型诺沃克病毒。对于其它感染因子，本试剂盒检测结果为阴性。贮存与运输条件² 本试剂盒必须在-20下避光保存，有效期为6个月。² 需在低温下运输。注意事项² 本试剂盒仅用于

3、体外检测使用，操作人员必须经过培训并具有一定的经验，试剂盒使用前请仔细阅读说明书全文。² 请严格按照基因扩增检验实验室的管理规范进行实验操作：如PCR实验严格分区操作；各区应有专用的手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染；工作人员应遵循从一区到二区的单方向工作原则，各工作区相对隔离；进行PCR实验的工作桌面和及相关物品应定期用1%次氯酸钠、75%酒精、1mol/L盐酸或紫外灯进行灭菌和消毒。² 所用的吸头和离心管都需要经DEPC水处理，以灭活RNA酶，75%乙醇也要用DEPC处理过的水配制。² 试剂盒中各试剂充分融化后请短暂离心。反应液分装时应尽量避免产生气泡。上

4、机前应注意检查各反应管是否盖紧，以免污染仪器。适用荧光PCR仪品牌与型号² Cepheid公司的SmartCycler² ABI公司的Prism7000、7700、7500、9600系列² Stratagene公司的MX3000、MX4000² Corbett Research公司的Rotor-Gene 3000² Bio-Rad公司的iCycler系列、MJ opticon2² Roche公司的LightCycler等实验操作步骤² RNA提取：用户可采用通用型病毒RNA提取试剂盒提取诺沃克病毒RNA用于检测或保存于-20

5、（-80更佳）以待检测。² 扩增试剂准备（在试剂贮存和准备区完成）Ø 从试剂盒中取出RT-PCR一步法反应液，冰盒上融化后混匀，取出Taq酶和逆转录酶。试剂在使用前2000rpm离心20s。 Ø 设需要的PCR反应管管数为N（N = 待检样本数X份 + 1管阴性对照 +1管阳性对照）。Ø MIX的配制：首先吸取反应混合液至1.5ml灭菌离心管，体积22.1×N (µl)，再加入Taq DNA聚合酶0.4×N (µl)和逆转录酶0.5×N (µl)到1.5ml灭菌离心管，混匀后短暂离心（2000r

6、pm/20s），然后向N 个0.2ml PCR反应管中分装已加入Taq酶和逆转录酶的MIX各23µl/每管，盖紧管盖。每个测试反应体系配制为：PCR反应液22.1µl+0.4µl Taq酶+0.5µl逆转录酶。 Ø 注意：阴性对照管建议在此区中加入2µl阴性对照样品。² 加样（在样品制备区完成）Ø 阳性对照取出解冻，使用前2000rpm 离心20s。Ø 若样本提取物保存在-20，则在使用前置室温解冻；向N个PCR管中分别加入待检样本RNA（包括阳性对照）2µl，盖紧管盖，2000rpm离心20s

7、，将PCR反应管转移至核酸扩增区。注意做好样品号标记。² PCR扩增（在核酸扩增区完成）Ø 上机前应检查各反应管是否盖紧。Ø 反应体系设为25µl；荧光信号采集设定在退火温度。对于多通道荧光PCR仪，选择荧光素FAM为信号采集通道。Ø PCR循环参数为：第一阶段，50 30 min反转录第二阶段，95 3min 预变性第三阶段，95 10s；60 40s × 40次循环² 质量控制标准及结果判断Ø 阴性对照CT值应显示为0或40.0，阳性对照的CT值应30.0，否则视实验失败，需重做。Ø 检测样品CT35.0，结果有效，可直接报告样品阳性；Ø 检测样品35.0<CT>40.0，需进行一次重复实验，若CT特性，同时阴性对照Ct值为零，可报告样品阳性，否则报告样品阴性。Ø 检测样品CT值为零，报告样本阴性。 ² 部分仪器阈值设定方法Ø 对于MJ Opticon2系列荧光定量PCR检测仪进行结果分析时，扣除本底后再输入循环1-15之间的荧光值，进行CT值的设置或拖